Podcasts about die depletion

It's almost beyond belief. Competitors pay thousands of dollars for a coach, work their asses off, do everything asked of them, and look their worst on contest day. And some of them actually die. Excuse us as we bang our heads against the wall one more time with another series on Peak Week, but this time we bring the receipts. Listen in as we go line-by-line through the plan of a coach who gets it all wrong. CONTEST PREP UNIVERSITY - THE SCIENCE OF STAGE-READY Joe Klemczewski, PhD, founder of THE DIET DOC and legendary TEAM KLEMCZEWSKI PERFECT PEAKING, has joined Adam Atkinson, founder of SEE YOU LATER LEANER, to bring you the science of Peakology in an informative daily video catalog! Learn how to master the stage from the coach who pioneered the contest prep coaching industry! Together, Klemczewski and Atkinson have helped clients win more than 500 pro cards, 200 pro titles, and 25 world championships. It's time for your best condition and your biggest win! CONTEST PREP UNIVERSITY COMPLETE PLAYLIST: https://thedietdoc.com/contestprepu THE DIET DOC CONTEST PREP PROGRAM OPTIONS: https://thedietdoc.com/contest-prep OUR OTHER PODCAST: THE MIND-MUSCLE CONNECTION https://www.youtube.com/playlist?list=PLaFD0Y6EtWHNAvcX9hmj7FHBNdWUa1GvE Joe Klemczewski, PhD, and Tyler Wiebe, BSc, have teamed up to connect the grind of the iron to the power of your mind. {~} Klemczewski is the founder of The Diet Doc, LLC, The Flexible Dieting Institute, the National Academy of Metabolic Science coaching certification program, the Nutrition Coaching Global Mastermind, Apex Coach nutrition professional mentorship program, and Contest Prep University. Known as the Godfather of Flexible Dieting and macronutrient tracking, Klemczewski, a former WNBF professional bodybuilder, has helped almost 500 clients win pro cards and more than 150 pro titles. {~} Tyler Wiebe was selected by Paul Revelia as one of Pro Physique's original coaches. Wiebe's expertise in kinesiology and his dedication to the client experience sets him apart as a model to the next generation of coaches. {~} Together, Klemczewski and Wiebe will take you through the real life challenges and strategies to make your training and competition experience a mental force that powerfully matches your effort in the gym. The Mind-Muscle Connection podcast is your source to build a winning mindset, unleash powerful mental growth, and make the world of physique and strength sport endlessly rewarding! The Diet Doc, LLC, is the parent company to many health, fitness, nutrition, and behavioral projects. Founded 25 years ago by Joe Klemczewski, PhD, known as the Godfather of Flexible Dieting, The Diet Doc is equipping the next generation of nutrition coaches. Joe has created the Flexible Dieting Institute, the Nutrition Coaching Global Mastermind, The Mind-Muscle Connection Podcast, and Contest Prep University. Whether you're listening to a podcast or interview as a life transformation client, a physique sport competitor, a performance athlete, a fitness entrepreneur, or just need some life motivation, Joe won't disappoint! SUBSCRIBE TO THIS CHANNEL: http://www.youtube.com/subscription_center?add_user=thedietdocweightloss HOW WE CAN HELP YOU IN YOUR FITNESS CAREER! * Become a member of the Flexible Dieting Institute Professional Coach Association and let us help you build an amazing career!" www.FDI.Coach * Become a National Academy of Metabolic Science Certified Nutrition Consultant: www.namscoach.com * Become a National Academy of Metabolic Science Physique Sport & Transformation Coach: www.namscoach.com LET'S CONNECT! Website: https://www.thedietdoc.com Facebook: https://www.facebook.com/joe.klemczewski Instagram: https://www.instagram.com/joeklemczewski Audio Podcast: https://soundcloud.com/thedietdoc

Es gibt zahlreiche Bemühungen, neue Immuntherapien zur Behandlung von malignen Tumoren zu entwickeln, da die Prognose vieler Krebserkrankungen immer noch schlecht ist. Dazu muss das Verständnis, wie die verschiedenen Immunzellen innerhalb des Tumormilieus miteinander interagieren, verbessert werden. Mausmodelle für Spontantumoren spiegeln die klinische Situation besser wider als transplantierbare Tumoren und stellen somit eine gute Möglichkeit dar, die während der Tumorentwicklung stattfindenden Immunreaktionen zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurde mit Mäusen gearbeitet, in deren B-Zellen das Onkogen c-MYC konstitutiv exprimiert wird und die nach einigen Wochen spontan B-Zell-Lymphome entwickeln. Frühere Arbeiten haben bereits gezeigt, dass natürliche Killerzellen (NK-Zellen) aus c-MYC-Tumoren im Vergleich zu Organen aus Wildtyp (wt)-Mäusen kaum Interferon-gamma (IFN-) produzierten und die Fähigkeit, Zielzellen zu töten, stark reduziert war. Dementsprechend sezernierten Tumor-infiltrierende dendritische Zellen (TIDZ) geringere Mengen Interleukin-12 (IL-12), das für die Induktion einer Th1 (T-Helferzelle 1) / ZTL (zytotoxischer T-Lymphozyt)-Antwort essenziell ist, aber vermehrt das immuninhibierende Zytokin IL-10. Für die Aktivierung von naiven T-Zellen ist die Hilfe von NK-Zellen und DZ notwendig, die in c-MYC-Mäusen offenbar nicht gegeben war. Es wurde daher erwartet, dass intratumorale T-Zellen nicht bzw. nur ungenügend aktiviert werden. Überraschenderweise wiesen Tumor-infiltrierende T-Zellen jedoch einen aktivierten Phänotyp auf, zeigten zum Teil sogar eine erhöhte IFN--Produktion, konnten degranulieren und proliferierten in vivo. Trotzdem übernahmen intratumorale T-Zellen im Gegensatz zu NK-Zellen keine immunüberwachende Funktion über die Lymphomentstehung, da c-MYC-Mäuse nach Depletion der T-Zell-Population nicht früher erkrankten als unbehandelte Tiere. Offenbar wurden T-Zellen in c-MYC-Tumoren Antigen-spezifisch aktiviert, was dazu führte, dass sie aufgrund der langanhaltenden Stimulation in einen Erschöpfungszustand geraten sind. Dies spiegelte sich in einer hohen Expression des Erschöpfungsmarkers PD-1 (Programmed Cell Death 1) wider. Die Interaktion des koinhibitorischen Rezeptors PD-1 mit dem entsprechenden Liganden PD-L1, der vor allem auf DZ in c-MYC-Tumoren detektiert wurde, führt in T-Effektorzellen zur Inhibierung des aktivierenden T-Zell-Rezeptor (TZR)-Signals. So konnten T-Zellen aus c-MYC-Tumoren im Vergleich zu T-Zellen aus normalen Mäusen in vitro über den TZR tatsächlich nicht mehr stimuliert werden, was ebenfalls für eine Erschöpfung sprach. Zudem exprimierten intratumorale T-Zellen neben PD-1 die koinhibitorischen Moleküle CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Antigen 4) und LAG-3 (Lymphocyte Activation Gene 3). Die Stimulierbarkeit der T-Zellen in vitro konnte durch Zugabe blockierender Antikörper (AK) gegen PD-1 und CTLA-4 verbessert werden. Aufgrund dieser Beobachtung wurden junge, noch gesunde c-MYC-Mäuse mit diesen AK behandelt. Durch die PD-1/CTLA-4-Blockade in vivo zeigten die Tiere ein signifikant verlängertes Überleben. Neben CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten wurde in c-MYC-Tumoren innerhalb der CD4+ T-Zellpopulation ein sehr hoher Anteil Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (Treg) detektiert. Diese waren aktiviert, proliferierten in vivo und produzierten IL-10. Die koinhibitorischen Moleküle, welche auch auf erschöpften T-Zellen zu finden waren (PD-1, LAG-3 und CTLA-4), wurden ebenfalls von Treg exprimiert, was bekanntlich zur Verstärkung ihrer suppressiven Aktivität führt. Es wurden vor allem Helios-exprimierende natürliche Treg (nTreg) detektiert. Doch auch IL-10-produzierende, regulatorische Foxp3- Tr1-Zellen (T Regulatory Type 1 Zelle), die zu den induzierten Treg (iTreg) zählen, waren in c-MYC-Tumoren zu finden. Schließlich fanden sich auch T-Zellen, die sowohl IFN- als auch IL-10 produzierten. Diese könnten aus Th1-Zellen entstanden sein, welche die Zytokinexpression umgestellt haben. Treg unterdrückten in c-MYC-Tieren anscheinend eine effektive Antitumor-Immunantwort. Daher wurden Foxp3+ Treg in DEREG/c-MYC-Mäusen, die einen transgenen Diphtherietoxin (DT)-Rezeptor tragen, spezifisch durch DT-Injektionen in vivo depletiert. Erstmals wurde der DEREG-Mechanismus zur Treg-Depletion in einem endogenen Tumormodell angewandt. Die Depletion der Foxp3+ Treg verschaffte den DEREG/c-MYC-Mäusen einen leichten Überlebensvorteil. Diese Ergebnisse sind relevant für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Verfahren zur Behandlung maligner Erkrankungen in der Klinik.

Wurminfektionen und allergische Reaktionen sind mit einer starken Zunahme von Interleukin-4 (IL-4)-produzierenden Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems assoziiert. In dieser Arbeit wurden einige grundlegende Eigenschaften IL-4-produzierender Zellen des angeborenen Immunsystems untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Zunahme eosinophiler und basophiler Granulozyten nach Infektion mit dem gastrointestinalen Nematoden Nippostrongylus brasiliensis auf unterschiedliche Art reguliert wird: Basophile Granulozyten nehmen durch eine erhöhte de novo Bildungsrate im Knochenmark zu, während die Anzahl eosinophiler Granulozyten durch eine erniedrigte Apoptoserate in peripheren Organen erhöht wird. Durch Immunfluoreszenzfärbungen N. brasiliensis-infizierter Mäuse konnte hier erstmals gezeigt werden, dass sich beide Zelltypen in der roten Pulpa der Milz nahe der Marginalzone ansammeln, während Mastzellen im Marginalsinus lokalisiert sind. Ferner wurde eine Zunahme eosinophiler und basophiler Granulozyten in der Lamina propria des Dünndarms und in der Lunge festgestellt, wobei basophile Granulozyten gleichmäßig verteilt im Parenchym der Lunge vorliegen, während eosinophile Granulozyten hauptsächlich in perivaskulären und peribronchialen Bereichen lokalisiert sind. Die funktionelle Charakterisierung von basophilen Granulozyten zeigte, dass diese durch sekretorische Produkte von N. brasiliensis-Larven aktiviert werden können, wenn sie zuvor mit Serum infizierter Mäuse sensibilisiert worden waren. Zudem können basophile Granulozyten die alternative Aktivierung von Makrophagen veranlassen und die Zunahme eosinophiler Granulozyten in vivo verstärken. Die Depletion von basophilen Granulozyten zeigte, dass sie an der Eliminierung einer primären und sekundären N. brasiliensis-Infektion entscheidend beteiligt sind. Des Weiteren konnte die Bedeutung von dendritischen Zellen (DC) durch Verwendung von genetisch DC-defizienten Mäusen für die Initiierung einer effizienten Immunantwort gegen N. brasiliensis bewiesen werden. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle von Zellen des angeborenen Immunsystems bei einer Th2-Immunantwort und könnten somit auch zum besseren Verständnis von Th2-assoziierten Krankheitsbildern beitragen.

Während der Zellproliferation müssen Zellwachstum und Zellteilung koordiniert werden. Die Kopplung erfolgt in der Hefe durch einen Komplex aus Nop7p, Erb1p und Ytm1p, der sowohl an der Ribosomenbiogenese als auch an der Kontrolle der DNA-Replikation beteiligt ist. Die homologen Proteine Pes1, Bop1 und WDR12 werden in Säugern von Zielgenen des Transkriptionsfaktors c-Myc, einem zellulären Onkoprotein, kodiert. In dieser Arbeit wurde die Existenz eines evolutionär konservierten Komplexes aus Pes1, Bop1 und WDR12 (PeBoW-Komplex) in Säugern belegt. Dabei wurde gezeigt, dass Bop1 als zentrales Protein des Komplexes agiert und die Interaktion von Pes1 und WDR12 vermittelt. Die Integrität des Komplexes ist wesentlich für seine Funktion. Die Depletion einzelner Komponenten sowie die Überexpression des integrierenden Proteins Bop1 hemmen die Reifung der Vorläufer-rRNA der großen ribosomalen Untereinheit sowie die Proliferation der Zellen. Bop1-Überexpression führt zur Ausbildung von zwei Subkomplexen aus Bop1 und Pes1 bzw. Bop1 und WDR12. Während der Bop1/Pes1-Subkomplex als Teil der pre-Ribosomen im Nukleolus lokalisiert, wird WDR12 durch Bop1-Überexpression im Zytoplasma gehalten und fehlt im Nukleolus zur Ausbildung eines funktionellen PeBoW-Komplexes. Pes1 und WDR12 können unabhängig in den Nukleolus translozieren, während Bop1 dafür die Interaktion mit Pes1 benötigt. Untersuchungen zur Stabilität der einzelnen PeBoW-Komponenten zeigten, dass monomeres Bop1 extrem instabil ist, durch Inkorporation in den PeBoW-Komplex aber vor Abbau geschützt wird. Möglicherweise werden hierdurch interne PEST-Sequenzen in Bop1 maskiert. Die Menge an Bop1 ist somit abhängig von der Anwesenheit von Pes1 und WDR12. Die gegenseitige Abhängigkeit der Stabilität aller drei PeBoW-Komponenten konnte in weitergehenden Experimenten gezeigt werden. Schließlich wurde untersucht, ob der PeBoW-Komplex die Ribosomenbiogenese mit der DNA-Replikation über Interaktion mit dem ORC-Komplex, wie in der Hefe beschrieben, koordiniert. Mit Hilfe der BiFC-Methode konnte eine Interaktion von Pes1 mit Orc6, eines Faktors des ORC-Komplexes, gezeigt werden. Die koordinierende Funktion des PeBoW-Komplexes für Zellwachstum und Zellproliferation scheint von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert zu sein.

Um eine Parthenogenese zu verhindern, arretieren reife Oozyten von Wirbeltieren in der Metaphase der Meiose II. Diese biochemische Aktivität wurde 1971 als Zytostatischer Faktor (engl. Cytostatic Factor; CSF) beschrieben. Einzelne wichtige Komponenten wurden im Laufe der Zeit identifiziert, aber deren Zusammenspiel noch nicht aufgeklärt. Eine wichtige Rolle spielt dabei der Anaphase Fördernder Komplex (engl.Anaphase promoting complex/Cyclosome;APC/C), eine Ubiquitin-Ligase welche Zellzyklus regulierende Proteine dem Abbau zuführt und somit den Beginn der Anaphase ermöglicht. Der APC/C ist in reifen Oozyten inaktiv und wird nach der Befruchtung aktiviert, so dass der Arrest aufgehoben wird. Des Weiteren sind für den Eintritt in die Anaphase II die Aktivitäten zweier Kinasen nötig. Erstens erfolgt während der Befruchtung ein Anstieg der Konzentration des intrazellulären Calciums, dies führt zur Aktivierung der Calmodulin-abhängigen-kinase-II (CaMKII). Allerdings waren die Substrate dieser Kinase bis jetzt unbekannt. Zweitens ist die Polo-like-kinase-1 (Plk1) essentiell für die Aufhebung des Metaphase II - Arrests. In Xenopus Eiextrakt konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Xenopus Plk1 (Plx1) essentiell für den Eintritt in die Anaphase ist. Kürzlich wurde ein Inhibitor des APC/C in einem Yeast-Two-Hybrid-Screen mit inaktiver Plx1 als bait gefunden – Xenopus-Emi1-verwandtes-Protein-1 (engl. Xenopus-Emi1-related protein-1; XErp1). Die Depletion dieses Proteins in Xenopus-Ei-Extrakt führt zu einem verfrühten Eintritt in die Anaphase. Im Rahmen meiner Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass CaMKII und Plx1 kooperieren, um XErp1 nach der Befruchtung zu inaktivieren, indem sie XErp1 für den Abbau markieren. Auch das humane Protein wurde kloniert und es wurde damit begonnen Versuche in Säugetierzelllinien durchzuführen. Erste Hinweise lassen darauf schließen, dass das humane Protein in gleicher Weise reguliert wird wie XErp1.

Die mitochondriale Außenmembran beherbergt eine Vielzahl an Proteinen, die anhand ihrer Topologie in unterschiedliche Klassen eingeteilt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biogenese von zwei Klassen untersucht. Die erste besitzt eine hydrophile cytosolische Domäne und ist über eine Transmembrandomäne im N-terminalen Bereich in der Membran verankert. Dieser N-terminale Bereich enthält die Signalsequenz dieser Proteine und dient gleichzeitig als Membrananker, weshalb er als Signal-Anker-Domäne bezeichnet wird. Zu dieser Proteinklasse gehören die beiden Rezeptorkomponenten des TOM-Komplexes, Tom20 und Tom70, und in S. cerevisiae das Protein OM45 mit bisher unbekannter Funktion. Zur Bestimmung der Bedeutung der Signal-Anker-Domäne für die Funktion des jeweiligen Proteins bzw. zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung dieses Sequenzabschnittes wurde ein Komplementationsansatz benutzt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Signal-Anker-Domänen mitochondrialer Außenmembranproteine funktionell austauschbar sind. Folglich spielen sie für die spezifische Funktion des Proteins nur eine untergeordnete Rolle, sind allerdings für den Transport zu den Mitochondrien und für die Verankerung in der Außenmembran von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren konnte ich die strukturellen Elemente bestimmen, die zusammen mit der Ankerdomäne das topogene Signal bilden. Eine moderate Hydrophobizität der Transmembrandomäne scheint am wichtigsten zu sein, um diese Proteine zu Mitochondrien zu dirigieren. Eine positive Nettoladung in beiden flankierenden Regionen der Transmembrandomäne erhöht die Effizienz des Transports zu den Mitochondrien und die Membraneinbaurate, ist aber keine essenzielle strukturelle Eigenschaft dieses Signals. Zusätzlich zur Charakterisierung der Signal-Anker-Domänen wurde der Importmechanismus dieser Proteinklasse untersucht. Dieser ist gemäß unserer Ergebnisse nicht von den bekannten Importrezeptoren, Tom20 und Tom70, abhängig, benötigt aber sehr wohl die zentrale Tom-Komponente Tom40. Im Gegensatz zu Vorstufen von Proteinen interner mitochondrialer Kompartimente und von beta-Barrel-Proteinen der Außenmembran scheinen die Vorstufen von Proteinen mit einer Signal-Anker-Domäne nicht über den von Tom40 gebildeten Kanal importiert zu werden. Höchstwahrscheinlich werden diese Proteine durch andere Teile von Tom40 erkannt und anschließend an der Protein-Lipid-Interphase in die Membran eingebaut. Die zweite untersuchte Proteinklasse der mitochondrialen Außenmembran sind die beta-Barrel-Proteine, welche über mehrere antiparallele beta-Faltblätter in der Membran verankert sind. Diese Proteine sind neben Mitochondrien in der Außenmembran von Chloroplasten und gram-negativen Bakterien zu finden. Zu Beginn dieser Arbeit war wenig über die Biogenese mitochondrialer beta-Barrel-Proteine bekannt. Wir konnten zeigen, dass diese Proteinklasse über einen evolutionär konservierten Weg in Mitochondrien importiert wird. Beta-Barrel-Proteine werden zunächst mit Hilfe des TOM-Komplexes zur Intermembranraumseite transportiert. Von dort werden sie durch einen zweiten oligomeren Proteinkomplex, den TOB-Komplex, in die Außenmembran eingebaut. Als erste Tob-Komponente konnten wir das essenzielle Protein Tob55 identifizieren und charakterisieren. Es kann eine Pore in Lipidmembranen bilden und könnte folglich für die Insertion der beta-Barrel-Vorstufen in die Außenmembran verantwortlich sein. Mas37 wurde ebenfalls als Bestandteil dieses Komplexes beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Komponenten konnte ich Tob38 mit Tob55 zusammen reinigen. Tob38 ist wie Tob55 essenziell für das Wachstum von Hefezellen und für die Funktion des TOB-Komplexes. Es ist auf der Oberfläche der mitochondrialen Außenmembran lokalisiert. Tob38 interagiert mit Mas37 und Tob55 und ist auch in Abwesenheit von Mas37 mit Tob55 assoziiert. Der Tob38-Tob55 Kernkomplex bindet Vorstufen von beta-Barrel-Proteinen und ermöglicht deren Einbau in die Außenmembran. Die Depletion von Tob38 führt zu stark verringerten Mengen an Tob55 und Mas37 und die verbleibenden Proteine bilden keinen Komplex mehr. Der Import von beta-Barrel-Vorstufenproteinen in Tob38-depletierte Mitochondrien ist stark beeinträchtigt, wohingegen andere Außenmembranproteine oder Proteine anderer mitochondrialer Subkompartimente mit gleicher Effizienz wie in Wildtyp-Organellen importiert werden. Demnach besitzt Tob38 eine äußerst wichtige und spezifische Funktion bei der Biogenese von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen. Es könnte für die Stabilität und Assemblierung des TOB-Komplexes notwendig sein oder an der Ausbildung einer transienten Assoziation zwischen dem TOM- und dem TOB-Komplex beteiligt sein und dabei den Transfer von Vorstufenproteinen erleichtern. Andererseits könnte Tob38 auch als Regulator der von Tob55 gebildeten Pore fungieren. Mim1 konnte im Rahmen dieser Arbeit als eine weitere am Import bzw. der Assemblierung des beta-Barrel-Proteins Tom40 beteiligte Komponente charakterisiert werden. Die Depletion von Mim1 führt zu stark verringerten Mengen an assembliertem TOM-Komplex und zur Akkumulation von Tom40 als niedermolekulare Spezies. Wie alle mitochondrialen beta-Barrel-Proteine werden die Vorstufen von Tom40 durch den TOB-Komplex in die Außenmembran eingebaut. Mim1 wird höchstwahrscheinlich nach diesem TOB-abhängigen Schritt benötigt. Aufgrund der starken Konservierung im Bereich des Transmembransegments von Mim1 beim Vergleich der Proteinsequenzen verschiedener Pilze könnte das Protein als eine Art Membran-Chaperon fungieren. Dabei könnte Mim1 notwendig sein, um nicht oder teilweise assembliertes Tom40 in einer kompetenten Form für die Assemblierung mit den kleinen Tom-Proteinen und mit Tom22 zu halten. Mim1 ist weder eine Komponente des TOM-Komplexes noch des TOB-Komplexes, sondern scheint vielmehr Bestandteil eines weiteren, bisher nicht charakterisierten Komplexes zu sein. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Mim1 eine spezifische und unverzichtbare Rolle bei der Assemblierung des TOM-Komplexes spielt.

In dieser Arbeit wurde die biologische Funktion der PTP-Meg2 in der zellulären Signaltransduktion untersucht. Analysen mittels c-DNA-Filter, „Real Time PCR” und Immunblot zeigen eine ubiquitäre Expression der PTP-Meg2 auf ähnlichem, jedoch geringem Niveau in fast allen untersuchten Krebszelllinien unterschiedlicher Gewebeherkunft, wobei die Expressions-stärke nicht in direktem Zusammenhang mit krebsrelevanten Eigenschaften wie Invasivität und Metastasierung steht. Die induzierte Differenzierung von MCF 7-Zellen durch Natriumbutyrat steigert die Meg2-Expression um das 5-fache, wogegen die Differenzierung von SW948- und SK-N- SH-Zellen mit TPA bzw. Retinolsäure die Meg2-Expression reprimiert. Zellfraktionierung und Immunfluoreszenz zeigen eine primär zytosolische, aber partiell auch vesikuläre bzw. strukturierte Lokalisation der PTP-Meg2, für welche die CRALBP-Domäne der PTP-Meg2 mitverantwortlich ist. Untersuchungen der endogenen Meg2-Aktivität nach Immunpräzipitation und in vitro Phosphatasetests zeigen eine erhöhte Phosphataseaktivität nach Stimulation von Zellen mit FCS, EGF und LPA, wogegen TPA stark inhibierenden wirkt. Aktivitätsstudien mit GST-Meg2-Fusionsproteinen zeigen, dass die CRALBP-Domäne die Meg2-Phosphataseaktivität negativ reguliert. Im Protein-Lipid-Overlay interagiert PTP-Meg2 mit PI(3)P, PI(4)P, PI(5)P und Phosphatidylserin. Eine Interaktion mit PI(4)P führt zu einer erhöhten Meg2 Aktivität. Pervanadat-Stimulation von Zellen führt zu einer Tyrosinphosphorylierung sowie einer Mobilitätsänderung der PTP-Meg2, was auch mit einer katalytisch inaktiven Meg2-Mutante beobachtet wurde. PTP-Meg2 interagiert in vitro und in Koexpressionsstudien mit dem EGF-Rezeptor in Abhängigkeit von dessen Aktivierung. Eine physiologische Relevanz konnte nicht gezeigt werden. Die Depletion der PTP-Meg2 durch spezifische siRNA führt zu einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung einiger, noch zu identifizierender Proteine. PTP-Meg2 vermindert, die inaktive PTP-Meg2CS-Mutante erhöht die durch v-ErbB und EGF-Rezeptor, nicht aber die durch HER2 und v-Ki-Ras induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen im Focusbildungstest. Zudem bewirkt PTP-Meg2CS, mit Ausnahme der v-Ki-Ras infizierten Zellen, eine leicht erhöhte ERK1/2-Aktivität. Ferner stimuliert PTP-Meg2 die Migration von NIH3T3-Zellen im Wundheilungsexperiment. Ein Einfluss auf die basale und durch Stimuli induzierte Proliferation von Zellen in Wachstumstests wurde nicht beobachtet. Ein durch siRNA-vermittelter Meg2- „knockdown“ führte zur Induktion bzw. Repression der Expression von Genen, wie z.B. einiger Liganden, Caveolin-2, Nck und Rock, was auf eine Beteiligung der PTP-Meg2 an der Regulation von Signalwegen kleiner GTPasen bzw. von endo- sowie exocytotischen Prozessen schließen lässt.

Zusammenfassung Trotz beträchtlicher Fortschritte in der antibiotischen Behandlung bakterieller Erkrankungen blieb der Krankheitsverlauf und die Sterberate der bakteriellen Meningitis, insbesondere der Pneumokokkenmeningitis, innerhalb der letzten Jahre unverändert. Mit der Erkenntnis, daß das Ausmaß der intrakraniellen Entzündung positiv mit dem Verlauf der Erkrankung korreliert, gewann die Frage nach der Rolle der Leukozyten im Rahmen des Krankheitsgeschehens zunehmend an Bedeutung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, die Bedeutung von Granulozyten, Monozyten und des Zusammenspiels dieser beiden Zellarten im Rahmen der pathophysiologischen Abläufe während der experimentellen Pneumokokkenmeningitis aufzudecken. Insbesondere wurden Veränderungen in den Parametern intrakranieller Druck, Liquorpleozytose und Blut-Hirnschrankenstörung in der Frühphase und im fortgeschrittenen Stadium der Meningitis untersucht. Hierfür kamen zwei Tiermodelle zur Anwendung: 1) Frühphase der Erkrankung: Hierbei wurde narkotisierten Ratten durch intrazisternale Injektion von Hitze-abgetöteten Pneumokokken (HKP) eine Meningitis induziert. Anschließend wurden über einen Zeitraum von sechs Stunden kontinuierlich Blutdruck, intrakranieller Druck und Temperatur überwacht. Eine Stunde vor Versuchsende erhielten die Tiere 1 ml Evans-blau zur Quantifizierung der Blut-Hirnschrankenstörung intravenös injiziert. Nach Ablauf des Beobachtungszeitraums wurden Liquorproben zur Bestimmung der Zellzahl und Evans-blau-Konzentration und Gehirnproben zur histologischen Aufarbeitung gewonnen. 2) Fortgeschrittenes Stadium der Erkrankung (Spätphase): In diesem Modell wurde die Meningitis mittels transkutaner Injektion von Streptococcus pneumoniae Serotyp 3 in die Cisterna magna ausgelöst. 24 Stunden nach Injektion wurden auch bei diesen Tieren die Leukozytenzahl und Evans-blau Konzentration im Liquor bestimmt sowie Gehirnproben zur weiteren Aufarbeitung gewonnen. Um die Beteiligung der Granulozyten an den pathophysiologischen Veränderungen während der Früh- bzw. Spätphase der bakteriellen Meningitis untersuchen zu können, wurden die Versuchstiere mit einem gegen polymorphkernige Leukozyten gerichteten Antikörper (Rabbit Anti-Rat-PMN-Antikörper) vorbehandelt, wodurch eine nahezu vollständige Depletion der Granulozyten erreicht wurde. Um ebenso die durch Monozyten bedingten Auswirkungen während der Frühphase der Pneumokokkenmeningitis feststellen zu können, wurde eine weitere Gruppe mit λ-Carrageenan vorbehandelt, einer Substanz, deren toxische Wirkung auf mononukleäre Zellen bekannt ist. In einer dritten Gruppe schließlich wurden beide Wirkstoffe in Kombination miteinander verabreicht. Für die Frühphase der Pneumokokkenmeningitis ergaben sich folgende Ergebnisse: 1) Die intrazisternale Gabe von Hitze-abgetöteten Pneumokokken führte im Verlauf von sechs Stunden bei den Ratten zu einem Anstieg des intrakraniellen Drucks, der Liquorleukozytenzahl und zur Störung der Blut-Hirnschrankenfunktion. 2) Die Depletion neutrophiler oder monozytärer Zellen bewirkte bei den Versuchstieren eine signifikante Reduktion der Liquorpleozytose und des intrakraniellen Druckanstieges. Gemessen an der Evans-blau-Extravasation wiesen diese Tiere auch eine geringere Funktionsstörung der Blut-Hirnschranke auf. 3) Bei den zweifach-depletierten Tieren waren diese Ergebnisse noch ausgeprägter. Sie zeigten bzgl. des intrakraniellen Druckanstieges, der Liquorpleozytose und Blut-Hirnschrankenfunktion keinen wesentlichen Unterschied zu unbehandelten Kontrolltieren. Für das fortgeschrittene Stadium der Meningitis zeigte sich folgendes: Nach Depletion granulozytärer Zellen ließ sich auch hier eine deutliche Reduktion des intrakraniellen Druckanstieges, der Liquorpleozytose und der Blut-Hirnschrankenstörung erreichen. Allerdings war diese Reduktion weitaus schwächer ausgeprägt als in den vorangegangenen Untersuchungen. Derzeit liegen noch keine Langzeituntersuchungen zur Wirkdauer des gegen polymorphkernige Leukozyten gerichteten Antikörpers vor. Daher ist nur zu vermuten, daß möglicherweise ein zunehmender Wirkverlust des Antikörpers während des Experiments für diese Diskrepanz verantwortlich sein könnte. Unterstützung findet diese Annahme durch den eindeutig höheren prozentualen Anteil neutrophiler Zellen in Differentialblutbildern von Langzeitversuchen verglichen mit denjenigen der Kurzzeitversuche. Da mit Carrageenan vorbehandelte Tiere zum Teil erhebliche Blutdrucksenkungen im Laufe des Experimentes aufwiesen, war es nicht möglich, diese Substanz in den Langzeitversuchen einzusetzen. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, daß Granulozyten, aber auch Monozyten eine essentielle Rolle im Hinblick auf die Ursachen pathophysiologischer Veränderungen während der Früh- und vermutlich auch der späteren Phase der Pneumokokkenmeningitis spielen. Andere Methoden zur Depletion monozytärer Zellen sollten künftig angewendet werden, um die Auswirkungen einer Monozyten-Depletion auf die fortgeschrittene Phase der Pneumokokkenmeningitis genauer untersuchen zu können. Es kommen verschiedene Mechanismen in Betracht, wie Granulozyten und Monozyten zu diesen Veränderungen führen können: 1) Neutrophile sind als Produzenten gewebezerstörender Faktoren bekannt. Ihr Waffenarsenal umfaßt eine Vielzahl toxischer Metabolite, darunter freie Sauerstoffradikale, Stickstoffmonoxid und Enzyme wie Matrix-Metalloproteinasen. In vorangegangenen Studien wurde bereits die Relevanz dieser Mediatoren für die bakterielle Meningitis belegt (z.B. Pfister et al., 1990 a,b; Koedel et al., 1995; Paul et al., 1998). Ohne Mithilfe anderer Mitglieder des Immunsystems sind Neutrophile nicht fähig zwischen fremden und wirtseigenen Antigenen zu unterscheiden; ihre „Waffen“ richten sich in diesem Fall auch gegen den eigenen Wirt. Frühere Studien zeigten, daß im Liquorraum von einem Komplementmangel ausgegangen werden muß und somit hier der zellulären Abwehr die nötige Unterstützung fehlt, um das richtige Ziel der Zerstörung preiszugeben. 2) Monozyten/Makrophagen gelten als Hauptproduzenten von IL-1 und anderen Chemokinen, die als chemotaktisches Signal für Neutrophile dienen. Sie stellen damit unverzichtbare Komplizen und Vorläufer für granulozytäre Zellen dar, da sie wesentlich an deren Immigration in den Subarachnoidalraum beteiligt sind. Ferner könnten mononukleäre Zellen durch ihre Freisetzung von Glutamat direkt an den auftretenden Schäden beteiligt sein.