Podcasts about hemmstoffe

Mandeln, Walnüsse, Kürbiskerne und Co. sind sehr gesunde Lebensmittel. Wir können aus gesund allerdings sehr gesund machen, wenn wir einen Trick anwenden, um Hemmstoffe vor dem Verzehr zu entfernen : Einweichen!

Werden wir überfluchtet mit Wissen zum Coronavirus oder doch nur mit Informationen, Daten und Spekulationen? Immer mehr erfahren wir über die klinischen Aspekte von COVID-19. Ein Thema nach wie vor ist das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System, das RAAS. Und immer mehr rücken Thromboembolien in den Fokus. Die Frage ist nur: Was ist gesichert, was ernst zu nehmen, was vielleicht weniger? Und welche therapeutischen, vielleicht sogar prophylaktischen Konsequenzen sollten Ärzte ziehen? Zu diesen Fragen machen wir in der heutigen Episode vom "CoronaUpdate" ein Evidenz-Update. Und wir reden darüber, was der Klimawandel mit COVID-19 zu tun hat. Quellen: 1. Victor G. Puelles et al. Multiorgan and Renal Tropism of SARS-CoV-2. New Engl J Med. May 13, 2020. doi: https://doi.org/10.1056/NEJMc2011400 2. Weber F., Anlauf M. (2019) Hemmstoffe des Renin-Angiotensin-Systems. In: Schwabe U., Paffrath D., Ludwig WD., Klauber J. (eds) Arzneiverordnungs-Report 2019. Springer, Berlin, Heidelberg. doi: https://doi.org/10.1007/978-3-662-59046-1_9 3. Katherine Mackey et al. Risks and Impact of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors or Angiotensin-Receptor Blockers on SARS-CoV-2 Infection in Adults. A Living Systematic Review. Ann Int Med 15 May 2020. doi: https://www.acpjournals.org/doi/10.7326/M20-1515 4. Dominic Wichmann et al. Autopsy Findings and Venous Thromboembolism in Patients With COVID-19. A Prospective Cohort Study. Ann Int Med May 6th 2020. Doi: https://doi.org/10.7326/M20-2003 5. Sigurd F. Lax et al. Pulmonary Arterial Thrombosis in COVID-19 With Fatal Outcome: Results From a Prospective, Single-Center, Clinicopathologic Case Series. Ann Int Med May 14th 2020. Doi: https://doi.org/10.7326/M20-2566 6. Christina Creel-Bulos, et al. Acute Cor Pulmonale in Critically Ill Patients with Covid-19. New Engl J Med May 6th 2020. Doi: https://doi.org/10.1056/NEJMc2010459 7. Julien Poissy, et al. Pulmonary Embolism in COVID-19 Patients: Awareness of an Increased Prevalence. Circulation 24 Apr 2020. doi: https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.120.047430 8. Ishan Paranjpe, et al. Association of Treatment Dose Anticoagulation with In-Hospital Survival Among Hospitalized Patients with COVID-19. JACC 2020. https://doi.org/10.1016/j.jacc.2020.05.001 9. Le Quéré, C., et al. Temporary reduction in daily global CO2 emissions during the COVID-19 forced confinement. Nat. Clim. Chang. (2020). https://doi.org/10.1038/s41558-020-0797-x

Verschiedene Augenerkrankungen beim Pferd erfordern eine systemische antiphlogistische Therapie. Im Vordergrund stehen hierbei die equine rezidivierende Uveitis sowie die Vor- und Nachbehandlung bei chirurgischen Eingriffen am Pferdeauge. Traditionell angewandte unselektive Hemmstoffe der Cyclooxygenasen (COX) wie Phenylbutazon sind in der Vergangenheit aufgrund ihrer insbesondere den Gastrointestinaltrakt betreffenden Nebenwirkungen zunehmend in Kritik geraten. Um das Risiko derartiger, hauptsächlich auf die COX-1-Hemmung zurückzuführender Wirkungen zu minimieren, wurden selektive Hemmstoffe der Cyclooxygenase 2 eingeführt. Mit dem den Wirkstoff Firocoxib enthaltenden Präparat Equioxx® ist erstmals ein selektiver COX-2-Hemmer aus der Klasse der Coxibe in der Gruppe der nicht-steroidalen Antiphlogistika für die Anwendung beim Pferd zugelassen. Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, ob klinisch erkennbare Unterschiede in der antiphlogistischen und analgetischen Wirkung von Firocoxib und Phenylbutazon bei Augenpatienten vorliegen. Ein zweites Ziel der Arbeit stellte die Untersuchung der Anreicherung der beiden Wirkstoffe im Glaskörperraum dar. Im Rahmen dieser Studie wurden insgesamt 140 Patienten mit unterschiedlichen Augenerkrankungen entweder mit Firocoxib (einmal täglich 0,1 mg/kg p.o.) oder mit Phenylbutazon (zweimal täglich 4 mg/kg) systemisch behandelt. Bezüglich der klinischen Wirksamkeit ergaben sich nur geringe Unterschiede zwischen Firocoxib und Phenylbutazon, wobei Phenylbutazon im Rahmen der Vitrektomie über eine signifikant bessere postoperative analgetische Wirkung verfügt. Im Gegensatz dazu reichert sich Firocoxib aufgrund seiner pharmakologischen Eigenschaften zu einem signifikant höheren Grad im Glaskörperraum an. Das Glaskörper : Serum – Verhältnis belief sich im Mittel für Firocoxib auf 19,3%, für Phenylbutazon nur auf 1,3%. Da die Unterschiede in der klinischen Wirksamkeit als gering einzustufen sind, sollte Firocoxib insbesondere bei Patienten mit einem erhöhten Risiko für gastrointestinale oder anderweitige durch unselektive Hemmung der Cyclooxygenasen bedingten Nebenwirkungen als wirksame Alternative bei der Behandlung von entzündlichen Augenerkrankungen oder als operationsbegleitende Therapie in Betracht gezogen werden.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein Studiendesign etabliert, um den Einfluss von Topiramat auf die Zielparameter Körpergewicht sowie Futter- und Wasseraufnahme und den Insulin- und Fettstoffwechsel unter kohlenhydratreicher Ernährung zu evaluieren. Es wurden insgesamt 4 Versuchsreihen im Paarfütterungsdesign durchgeführt. Homozygote Zuckerratten und db/db Mäuse erhielten über 1 bis 4 Wochen eine Hochdosis-Topiramattherapie (100 mg/kg/d) über eine orogastrale Sonde. Die db/db Maus erwies sich als nicht robust genug für das zu etablierende Studiendesign. Bei den Zuckerratten zeigte Topiramat den bekannten akuten anorektischen Effekt. Im Verlauf wurde bei den behandelten Tieren eine Verlangsamung der Wachstumsgeschwindigkeit gegenüber den Placebotieren trotz höherer oder gleicher Futteraufnahme deutlich. Dies lässt auf Wirkmechanismen des Topiramats schliessen, die das Energiegleichgewicht der Tiere auf metabolischer Ebene beeinflussen. Als ein wichtiger metabolische Effekt konnte die bereits vorbeschriebene antidiabetische Wirkung beobachtet werden. Daneben konnte erstmals eine Verminderung der de novo Lipogeneserate im weißen Fettgewebe nachgewiesen werden. Dieser Befund lässt der Carboanhydrasehemmung durch Topiramat eine zentrale Bedeutung für die gewichtsreduzierende Wirkung zukommen und gibt Anlass zur Erforschung weiterer Hemmstoffe, die nach Möglichkeit eine höhere Spezifität für das weiße Fettgewebe aufweisen sollten.

Gegenstand der Untersuchung sind etwaige geschlechtsspezifische Unterschiede bei der medikamentösen Sekundärprophylaxe der koronaren Herzkrankheit. Ergebnisse bisheriger Forschung weisen auf eine Minderversorgung der Frauen und eine dadurch ineffizientere Prophylaxe koronarer Ereignisse hin. Im Rahmen der prospektiven Follow-up-Studie zu geschlechtsspezifischen Unterschieden in der kardialen Rehabilitation [20] wurden an drei beteiligten Rehabilitationskliniken (LVAKliniken Höhenried und Bad Wörishofen, Privatklinik Lauterbacher Mühle, Bayern) 510 Patienten unter 75 Jahren, darunter 201 Frauen, mit Zustand nach erstem Myokardinfarkt oder angiographisch gesichertem, akuten koronaren Erstereignis rekrutiert. Zu Anfang, am Ende und 1,5 Jahre nach der stationären Rehabilitationsmaßnahme wurden unter anderem Daten zur pharmakologischen Therapie erhoben. Diese ermöglichen Rückschlüsse auf das ärztliche Verordnungsverhalten gegenüber Frauen und Männern im Akutkrankenhaus, in der Rehabilitationsklinik sowie im niedergelassenen Bereich. Angaben zu Begleiterkrankungen wurden ebenso wie zahlreiche weitere Einflussfaktoren der Medikamentenverschreibung bei der Datenerhebung berücksichtigt. Die Annahme einer generellen Unterversorgung von Frauen in der medikamentösen Sekundärprophylaxe bestätigt sich nicht. Allerdings erhalten jüngere Frauen (bis 60 Jahre) zum Zeitpunkt der Entlassung aus dem Akutkrankenhaus signifikant weniger Medikamente zur Sekundärprophylaxe verordnet als Männer (p

Fri, 17 Nov 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6196/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6196/1/Eckert_Saskia.pdf Eckert, Saskia

Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Bereiche gegliedert. Der erste Themenbereich beschäftigte sich mit der Transformation von pflanzlichen Mitochondrien bzw. mit den Voraussetzungen, die erfüllt sein müssen, um Mitochondrien höherer Pflanzen zu transformieren. Im zweiten Themenbereich wurde die Regulation der Lysinbiosynthese erstmals mit Hilfe der Plastidentransformation modifiziert sowie ein universeller plastidärer Selektionsmarker entwickelt und etabliert. Mitochondrientransformation- In dieser Arbeit wurden zwei Strategien zur Transformation von Mitochondrien höherer Pflanzen entwickelt. Zum einen wurde ein mitochondrienspezifischer Ansatz gewählt, d.h. es wurden Selektionsmarker verwendet, die eine hemmende Wirkung auf die Atmungskette der Mitochondrien besitzen. Zum anderen wurden in Anlehnung an seit die seit 1990 erfolgreich durchführbare Plastidentransformation generelle Inhibitoren der Proteinbiosynthese verwendet, welche durch die Produkte der entsprechenden in die Mitochondrien eingebrachten Resistenzgene detoxifiziert werden sollten. Markergenstrategie- Geeignete Selektionsbedingungen zur Identifizierung von mitochondrialen Transformanten wurden bei Tabakblättern und Tabakprotoplasten mit den Antibiotika Blasticidin, Chloramphenicol und Hygromycin als Hemmstoffe ermittelt. Aus Transformationen mit den mitochondrialen Transformationskassetten pBMhph II, pBMhph III und pBMhph IV konnten über 200 Hygromycin-resistente Linien selektiert und charakterisiert werden. PCR- und Southern-Analysen lassen bei mindestens 7 Linien eine zielgerichtete mitochondriale Integration des Transgens vermuten. Möglicherweise sind aber nur wenige Kopien des Transgens in das Mitochondriengenom inseriert bzw. repliziert worden, was eine eindeutige Charakterisierung erschwert. Bei einer großen Anzahl resistenter Linien handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle zielortfremde Integrationen der Transformationskassetten in die Plastiden-, Kern- oder Mitochondriengenome. Mitochondrienspezifischer Transformationsansatz- Die in dieser Arbeit entwickelten mitochondrienspezifischen Transformationsvektoren pUMmyx II, pUMglu II, pUMarg II und pUManti II enthalten ein Fragment des mitochondrialen cob-Gens. In dieses cob-Fragment wurden Punktmutationen eingeführt, die zu einer Veränderung der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur des Apocytochroms b führen. Bei einer korrekten homologen Integration dieses modifizierten cob-Fragmentes in das Mitochondriengenom sind die Inhibitoren Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben nicht mehr in der Lage, an den Komplex III der mitochondrialen Atmungskette zu binden. Zur Bestimmung optimaler Selektionsbedingungen von mitochondrialen Transformanten mit den Hemmstoffen Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben wurden Testreihen mit Tabakblättern, Tabakprotoplasten sowie Tabak- und Arabidopsis-Suspensionskulturen durchgeführt. Bei „particle-gun“-Transformationen von Tabakblättern mit der Transformationskassette pUMarg II wurden 23 Moa-Stilben-resistente Linien selektiert. Bei 18 Linien konnte eine Integration des mutierten cob-Fragmentes eindeutig per PCR und Sequenzierung nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um eine mitochondriale Integration handelt, konnte nicht eindeutig belegt werden. In diesem Fall wäre jedoch zu klären, auf welchem Mechanismus der offensichtliche selektive Vorteil der mit dem Transformations-vektor transformierten Pflanzen beruht, da die Integration des cob-Gen-Fragmentes nur innerhalb des mitochondrialen Zielortes funktionell sein dürfte. Plastidentransformation- Bei dem plastidären Transformationsansatz dieser Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt. Zum einen wurde der „feedback“-Regulationsmechanismus der DHDPS innerhalb des Aspartat-Stoffwechsels durch die Integration eines insensitiven dhdps-Gens in die Plastiden von Tabak und Kartoffel beeinträchtigt. Der Gehalt der essentiellen Aminosäure Lysin wird somit gesteigert. Zum anderen wurde das insensitive dhdps-Gen als Markergen genutzt, um eine Selektion von plastidären Transformanten auf dem Lysinanalogon AEC zu ermöglichen. Erhöhung des Lysingehaltes- Es konnten 34 Spectinomycin-resistente Tabakklone selektiert werden, die mit der Transformationskassette pHoDh2b transformiert wurden. Die molekularbiologische Charakterisierung der Transformanten konnte bei 8 Linien eindeutig eine korrekte plastidäre Integration der Transgene belegen. Biochemische Analysen zeigen eine bis zu 32-fache Erhöhung an freiem Lysin im Blattgewebe von plastidären Transformanten. Es war damit erstmals mit der Plastidentransformation möglich, regulatorisch die Lysinbiosynthese zu verändern. AEC als plastidärer Selektionsmarker- AEC (S-Aminoethyl-L-Cystein) konkurriert als Lysinanalogon mit Lysin um den Einbau in Polypeptide. Wird die AEC-Konzentration im pflanzlichen Gewebe im Vergleich mit Lysin zu hoch, kommt es zum Erliegen des Stoffwechsels und damit zum Absterben der Zelle. Durch die Überproduktion von Lysin in den Transformanten verschiebt sich das Verhältnis von AEC → Lysin. Es wird somit kompetitiv mehr Lysin in die Polypeptide eingebaut. Dies lässt sich als Selektionsvorteil nutzen. Mit dem „Markergen“ dhdps-r1 und AEC als selektivem Hemmstoff wurden insgesamt 49 Tabaklinien selektiert. Bei 3 selektierten Linien konnte eindeutig die korrekte plastidäre Intergration der Transformationskassette nachgewiesen werden. Es ist damit erstmals gelungen, einen antibiotikumfreien universell einsetzbaren plastidären Selektionsmarker zu etablieren. In weiteren Transformationsexperimenten konnten mit dem gleichen „Markergen“ plastidäre Tomatentransformanten identifiziert und charakterisiert werden (Diplomarbeit L. Schaeffer). Damit ist es bereits bei 2 Spezies gelungen, AEC als selektiven Hemmstoff einzusetzen. Bei weiterer Optimierung der Selektionsbedingungen dürfte es möglich sein, auch bei weiteren Pflanzenspezies diesen universellen Selektionsmarker zu etablieren.

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, auf welchem Wege die beiden Zelltodrezeptoren TNFR1 und Fas Apoptose in den Zelllinien A9 und SV80 ausführen. Ausgangspunkt waren widersprüchliche Erkenntnisse über die Signalwege von TNFR1 und Fas. So war in der Literatur beschrieben, daß TNFR1 und Fas die gleichen intrazellulären Signalmoleküle benutzen um Apoptose auszulösen. Als diese Signalmoleküle wurden FADD, TRADD und FLICE identifiziert. Ergebnisse aus unserem Labor zeigten jedoch, daß in A9 Zellen der durch Fas oder TNFR1 ausgelöste Zelltod unterschiedliche Signalwege beschreiten musste, da sich der durch TNFR1 ausgelöste Zelltod bezüglich der Hemmbarkeit durch verschiedene Inhibitoren der Apoptose deutlich von dem durch Fas ausgelösten Zelltod unterschied. Es sollte untersucht werden, ob in SV80 und A9 Zelllinien FADD als gemeinsames Signalprotein beider Zelltodrezeptoren benutzt wird, oder bereits auf dieser Ebene ein Unterschied festzustellen ist. Dazu wurde FADD kloniert, und die Mutante DFADD von FADD hergestellt, die in der Lage ist, den bisher bekannten Signalweg von FADD in einer dominant negativen Weise zu hemmen. FADD und DFADD wurden in A9 und SV80 Zellen zur Expression gebracht. In SV80 Zellen führte Überexpression von FADD wie erwartet zu Zelltod, Expression von DFADD schützte nach Stimulation des TNFR1 oder Fas wie erwartet vor Zelltod. Expression von FADD in A9 Zellen führte zu Zelltod. Überraschenderweise führte jedoch auch Expression von DFADD in A9 zu Zelltod. Es war unerwartet, daß die Mutante, die den bisher bekannte Signalweg von FADD blockieren sollte, selbst Zelltod auslösen kann. Um die Art der Wirkung dieser Mutante DFADD weiter zu charakterisieren wurde versucht, den durch DFADD vermittelten Zelltod durch verschiedene Klassen von Hemmstoffe der Apoptose zu inhibieren. Zum einen Apoptoseinhibitoren, die über Hemmung der Caspasen wirken, zum anderen solche, die durch Hemmung der Atmungskette Apoptose unterbinden. Des weiteren wurde das Signalmolekül RAIDD und verschiedene dominant negative Mutanten kloniert, um zu untersuchen, ob DFADD in der Lage ist weitere Signalproteine zu aktivieren und so Zelltod auszulösen.

Die Anpassung der Gewebsdurchblutung an die unterschiedlichen Bedarfssituationen, setzt ein koordiniertes Verhalten der Gefäße im mikrovaskulären Gefäßnetz voraus. Diese Koordination der vasomotorischen Reaktionen im mikrovaskulären Gefäßsystem, ist möglicherweise auf die interzelluläre Kommunikation der Endothelzellen angewiesen. Die Endothelzellen und glattten Muskelzellen der Blutgefäße sind über Gap Junctions gekoppelt, auch eine myoendotheliale Kopplung wird diskutiert. Dadurch können Signale in Form von Ionen (und damit Änderungen des Membranpotentials) oder kleinen Moleküle über solche interzellulären Kanäle entlang der Endothelzellschicht weitergegeben werden. Völlig unbekannt ist aber, ob die Permeabilität dieser endothelialen Gap Junctions reguliert wird. Deshalb wurde in dieser Arbeit untersucht, ob vom Endothel gebildete lokal wirksame Gewebshormone (Autakoide, wie NO und Prostacyclin) die Durchlässigkeit der Gap Junctions beeinflussen. Hierzu wurde in konfluenten Kulturen von humanen umbilikalvenösen Endothelzellen (n=190) die Ausbreitung der Farbstoffe Carboxyfluoresein und Calcein nach Injektion in eine einzelne Endothelzelle in die benachbarten Endothelzellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß der injizierte Farbstoff tatsächlich nur über interzelluläre Kanäle von einer Zelle zur nächsten gelangt. Diese Kanäle werden von Connexinen gebildet, denn ein Peptid, das das Aneinanderdocken der Connexine verhindert, reduzierte die Ausbreitung des fluoreszierenden Farbstoffs. Daher kann mit dieser Methode tatsächlich die Kopplung der Zellen über Gap Junctions untersucht werden. Die erhobenen Daten zeigen, daß die Anzahl der fluoreszierenden Zellen nach Hemmung der NO-Synthase mit Nw-nitro-L-Arginin (L-NA, 30µmol/L) um bis zu 29% zunahm, während die anschließende erneute Freisetzung von NO durch zwei differente NO-Donoren (SNAP bzw. SNP, 1 µmol/L) die Zahl der fluoreszierenden Zellen wieder auf den Ausgangswert reduzierte oder sogar unterhalb den, der unbehandelten Kontrollzellen senkte. Diese durch NO hervorgerufene Wirkung blieb in Anwesenheit des Hemmstoffes der löslichen Guanylatcyclase ODQ (10 µmol/L) oder der Radikalfänger Tiron und Superoxiddismutase unverändert. Dies weist daraufhin, daß es sich bei dieser durch NO hervorgerufenen Hemmung um einen direkten Effekt von NO handelt, der weder über die Bildung von cGMP noch über eine gesteigerte Peroxynitritproduktion vermittelt wird. Auch eine Hyperpolarisation der Endothelzellen durch den Aktivator von KATP-Kanälen HOE234 (1 µmol/L) hatte keinen Einfluß auf die Kopplung der Zellen. Im Gegensatz dazu hatte NO in Anwesenheit der Hemmstoffe der Tyrosinphosphatase Orthovanadat (100 µmol/L) und Phenylarsinoxid (1 µmol/L) keinen Einfluß mehr auf die endotheliale Kommunikation via Gap Junctions. Dagegen führte die Behandlung der Zellen mit dem Tyrosinkinase Inhibitor Genistein (100 µmol/L) zu einer deutlichen Reduktion der endothelialen Kopplung (-14%), die mit der Wirkung von NO vergleichbar war. Daraus läßt sich schließen, daß die durch NO hervorgerufene Wirkung auf die interzelulläre Kommunikation über eine Verminderung der Tyrosinphosphorylierung vermittelt zu werden scheint. Außerdem zeigen diese Daten, daß Prostacyclin die endotheliale Kopplung signifikant steigert, und das diese Wirkung über das gebildete cAMP vermittelt wird. Denn nicht nur das Prostacyclin Analogon Iloprost (1 µmol/L), sondern auch der Aktivator der Adenylatcyclase Forskolin (30 µmol/L), verbesserte die Ausbreitung des Farbstoffes signifikant . Schließlich zeigen die Ergebnisse auch, daß die beiden vom Endothel gebildeten Substanzen sich gegenseitig in ihrer Wirkung auf die endothelialen Gap Junctions beeinflussen können. Die erhobenen Daten zeigen erstmals eine Rolle von NO und Prostacyclin in der Regulation der Permeabilität endothelialer Gap Junctions. Diese Regulationsmöglichkeit und die Auswirkungen einer vermehrten oder verminderten Kopplung der Endothelzellen wirft zahlreiche neue Fragestellungen auf z. B. hinsichtlich der Pathophysiologie der coronaren Herzkrankheit oder auch des arteriellen Hypertonus und bietet damit auch die Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten.

Ziel der Arbeit war es, die molekularen Mechanismen zu erforschen, durch die das Pasteurella multocida Toxin zu einer Aktivierung von Endothelzellen mit anschließender Störung der Barrierefunktion des Endothels führt. Dafür wurden humane Endothelzellen (HUVEC) verwendet, die für Permeabilitätsmessungen auf Porenmembranen bis zur Entstehung eines dichten Monolayers kultiviert wurden. Als Maß für die endotheliale Permeabilität wurde die Durchlässigkeit des endothelialen Monolayers für Meerrettichperoxidase verwendet. Zur Sichtbarmachung des endothelialen Zytoskeletts wurden die Zellen mit Rhodamin Phalloidin gefärbt und im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Mit Hilfe spezifischer Hemmstoffe, die teilweise in die Zellen mikroinjiziert wurden, sowie der biochemischen Messung von Enzymaktivitäten bzw. Phosphorylierung, erhielten wir folgenden Ergebnisse: 1. Das Pasteurella multocida Toxin führt zu einer Erhöhung der Permeabilität des endothelialen Monolayers über einen Rho-GTPase-abhängigen Signalweg. 2. Die Stimulierung der Endothelzellen mit dem Pasteurella multocida Toxin führt zur massiven Bildung von Aktinstreßfasern, die von Rho, seinem Zielprotein der Rho-Kinase als auch von der MLC-Phosphatase abhängig sind. Diese morphologischen Veränderungen stellen vermutlich die Basis für die Erhöhung der endothelialen Permeabilität dar. 3. Pasteurella mulocida Toxin führt über Rho und mit großer Wahrscheinlichkeit auch über die Rho-Kinase zu einer Inaktivierung der MLCPhosphatase mit anschließender Erhöhung der MLC-Phosphorylierung. Als Ergebnis unserer Arbeiten ergibt sich ein Signalweg, in dessen Zentrum die GTPase Rho steht und dessen Details noch einmal in der Abbildung 7-1 zusammengefaßt werden.

1.Die A1-ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal-c2 kloniert und in Escherichia coli exprimiert.Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.Die spezifischen Antiseren gegen die A1-ATPase- Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC,AhaE und AhaF wurden für die Studien dieser Arbeit eingesetzt. 2.Die für die hydrophile Domäne der A1-ATPase kodierenden Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden in den Überexpressionsvektor pGEM-4Z hinter die lac und T7-Promotoren kloniert.Dieses Konstrukt wurde pTL2 genannt.pTL2 enthält zusätzlich 162 Bp stromaufwärts von ahaE 3.Die auf pTL2 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert und die A1-ATPase funktionell synthetisiert.Die spezifische ATPase-Aktivität im zellfreien Extrakt von E. coli DK8 (pSÖ1)betrug 186 mU/mg Protein.Die Synthese der A1-ATPase-Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC und AhaF konnte nachgewiesen werden.AhaE und AhaG konnten nicht detektiert werden. 4.Die A1-ATPase wurde aus dem Zellextrakt von E. coli DK8 (pTL2)über Ultra- zentrifugation,Ammoniumsulfatfällung,Gelfiltration an BioPrep SE 1000/17, Ionenaustauschchromatographie an BioScale DEAE und einer zweiten Gelfiltration an Sephacryl S-300 HR bis zur apparenten Homogenität gereinigt. 5.Das gereinigte Enzym wies eine molekulare Masse von 355 kDa auf und setzte sich aus 5 verschiedenen Untereinheiten zusammen.Die einzelnen Untereinheiten AhaA (65 kDa),AhaB (55 kDa),AhaC (41 kDa),AhaD (28 kDa)und AhaF (9 kDa)wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert und wiesen im ATPase-Komplex eine Stöchiometrie von A3B3CDF auf.AhaE und AhaG waren nicht im Komplex enthalten. 6.Der ATPase-Testpuffer wurde für die heterolog exprimierte A1-ATPase optimiert (50 mM MES-HCl,40 mM Na-Acetat,30 mM NaHSO3,8 mM MgSO4,4 mM ATP,pH 5,2).Na-Acetat und Sulfit stimulieren die A1-A7.Die gereinigte A1-ATPase aus M. mazei Gö1 hydrolysierte Mg-ATP (im Verhältnis 2:1)als bevorzugtes Substrat mit einem V von 13 ± 3 U/mg Protein und einem K von 1,3 ± 0,3 mM für ATP. 8.DES,Hexestrol und Dienestrol wurden als spezifische Inhibitoren der archäellen A1-ATPase identifiziert.Die I Werte dieser Hemmstoffe betrugen 5 µmol Hexestrol/mg Protein,3 µmol DES/mg Protein und 6 µmol Dienestrol/mg Protein. 9.Quervernetzungsexperimente konnten belegen,dass die Kopien der Untereinheit AhaA in direkter Nachbarschaft zueinander stehen.Dies trifft auch für die Kopien der Untereinheit AhaB und für die Untereinheiten AhaA und AhaB untereinander zu.Zudem konnte eine direkte Nachbarschaft der Untereinheiten AhaA und AhaD festgestellt werden. 10.Die A1-ATPase besitzt eine dreifache Achsensymmetrie.Der Kopfteil der A1-ATPase ist hexagonal geformt und setzt sich aus sechs peripheren und einer zentralen Masse zusammen. 11.Die über Röntgenkleinwinkelstreuung ermittelten Dimensionen der A1-ATPase sind:Gesamtlänge =17,8 nm,Länge Kopfteil =9,4 nm,Stiellänge =8,4 nm, Stieldurchmesser =6 nm,Kopfdurchmesser (variabel,abhängig vom Substrat)= 10,06 nm,Kopfradius (variabel,abhängig vom Substrat)=5,03 nm. TPase,wohingegen sich alkoholische Lösungsmittel die ATPase-Aktivität hemmten.