Podcasts about isoleucin

Folge 66 #BCAA Aminosäuren, die vom Körper nicht selber hergestellt werden können, aber sehr wichtig sind. BCAAs können nur über die Nahrung aufgenommen werden. Am besten geht dies über Fleisch, Fisch, Hülsenfrüchte, Getreide, Nüsse... Diese Aminosäuren sind wichtig für den Muskelaufbau, die Fettverbrennung, für den Energiehaushalt und bestehen aus Leucin, Isoleucin und Valin. Mehr zum Thema hört ihr in der heutigen Podcastfolge. HIER ERFÄHRST DU MEHR: Alexandra Luczak, Dipl. Des., Achtsamkeitscoach https://kreativothek.de/ Insta: @kopffreimitalex @kreativothek.alex Alexandra Nau, Heilpraktikerin https://www.naturheilpraxis-alexandra-nau.de/ Insta: @naturheil_chiropraxis_nau

Protein - byggstenar för kroppen som hjälper oss som gillar att träna mycket att bibehålla och öka muskelmassan. Men hur mycket protein behöver du egentligen äta och hur tänker vi med vårt eget proteinintag? I det här kortavsnittet sammanfattar vi protein på 30 minuter och går igenom en studie från förra året på styrketränande kvinnor som fick käka mer eller mindre protein. I en studie från 2018 fick en grupp med styrketränande kvinnor köra samma träningsprogram och antingen äta efter WHO:s rekommendationer om proteinintag per dag (lågproteinkost) eller äta ett högt proteinintag. En högre mängd protein gav en ökad kroppsvikt, ökad fettfri massa (muskler) och minskad fettmassa. Jämfört med lågproteinkostgruppen som också ökade muskelmassan men inte alls lika mycket. Hög proteinkost 2,5g x kv/dag -2 kroppsfett % -1,1 fettmassa kg Fettfrimassa ökade med 2,1 kg Kroppsvikt ökade med 1 kg Låg proteinkost 0,8g x kv/dag -1,1 kroppsfett % -0,8 fettmassa kg Fettfrimassa ökade med 0,6 kg -0,2 kg kroppsvikt Viktiga saker att tänka på: Om du styrketränar mycket och vill gaina är rekommendationen för proteinintag att ligga mellan 1.4-2.0 g/kg kroppsvikt och dag. Om du vill få ut maximalt av all energi och tid du lägger ner på din träning, så rekommenderas du äta lite mer protein. Det är inte farligt att äta “för mycket” protein. I en långsiktig studie på ett år, där deltagarna åt 3 g/kg/dag visade inga negativa effekter på njur- och leverfunktion. Det är inte bråttom att få i dig protein i samband med styrketräningen. Ät dina vanliga mål mat, träna din träning. Det går att få i sig rekommenderad mängd protein per dag om du har koll och anstränger dig. Proteinrik mat FISK, KÖTT OCH ÄGG per 100 gram Tonfisk: 27 g Kyckling: 26 g Sardiner: 25 g Räkor: 24 g Kalkon: 22 g Rostbiff: 22 g Rökt lax: 21 g Ägg 13 gram Proteinrik mat BÖNOR OCH LINSER per 100 gram Sojabönor: 34 g Röda linser: 27 g Bruna linser: 25 g Mungbönor: 24 g Vita bönor: 21 g Kikärtor: 20 g Annat, ex Vitt bröd 10 g Havregryn 12 g Essentiella aminosyror Det finns tjugo aminosyror som bildar proteiner och av dessa är det åtta som kroppen inte kan tillverka själv – Fenylalanin, Tryptofan, Isoleucin, Metionin, Treonin, Leucin, Lysin och Valin. Dessa aminosyror kallas essentiella, då de är livsviktiga att få i sig via födan. För barn är även aminosyrorna Arginin och Histidin essentiella. Vegetabiliska livsmedel innehåller var för sig oftast inte de essentiella aminosyrorna i tillräckligt stor mängd, men tillsammans kompletterar de varandra. Detta kallas kompletterande verkan. Ett exempel är spannmål och baljväxter. Spannmål innehåller tillräckligt av aminosyrorna metionin och cystein som det finns begränsat av i bönor, ärtor och linser. Baljväxter innehåller mer av aminosyran lysin som det inte finns så mycket av i spannmål. Förutsatt att man inte äter väldigt ensidigt, får man därför i sig tillräckligt med protein även om mat äter enbart vegetarisk mat.

In diesem 43. Podcast geht es um die Kraft der Aminosäuren und welche Wirkungen eine einseitige Aufnahme bei Dir bewirken kann. Wir klären in diesem Podcast für Deinen Erfolg und Deine Erfüllung folgende Fragen: Sind Aminosäuren wirklich so wichtig als Bausteine des Lebens? Was ist ein Aminosäure-Pool? Warum sind die BCAAs so wirksam für Muskelaufbau? Wie kann ich Herpes Simples Bläschen aus meinem Leben verbannen? Warum sind die acht essentiellen Aminosäuren wirklich ein Hammer? Warum können zu viele Cashewkerne Probleme machen? Hier geht es zum POWER UP YOU LIFE SEMINAR: https://www.slatco-sterzenbach.com/shop/seminare/power-up-your-life Und hier geht es zum CFIT 4 LIFE & BUSINESS-Seminar: https://www.slatco-sterzenbach.com/shop/seminare/fit-4-life-business Gratis-Lebensrad: http://www.slatcosterzenbach.de/lebensrad/ ACHTUNG: Der Gutscheincode für unsere Seminare lautet: "Podcast18", damit erhältst Du 10% auf fast! alle unsere Seminare. Bei Fragen hier unsere Service-Hotline: 0800 - 47 66 64 63 (0800-IRONMIND) E-Mail: podcast@slatco-sterzenbach.com

In dieser Folge erfährst du mehr über die Getreidesorten Roggen und Gerste, die definitiv eine gute Alternative zu Weizen darstellen. Roggen ist eine verbreitete Getreideart aus der Familie der Süßgräser. Er liefert auch auf leichteren oder sandigen Böden und an kühleren oder feuchten Standorten noch gute Erträge. In Europa wird häufig Winterroggen angebaut, während Sommerroggen eine untergeordnete Bedeutung hat. Das Korn des Roggens wird für Nahrungs-, Futter- und Genussmittel verwendet. Auch wird die noch grüne Pflanze, Grünroggen, oder das bei der Ernte  zurückbleibende Stroh genutzt. Der Roggen besitzt 65 bis 200 Zentimeter lange Halme und 5 bis 20 Zentimeter lange Ährenaus einzelnen, meist zweiblütigen Ährchen mit schmalen Hüllspelzen Der Roggen ist einjährig, meist winterhart – Winterroggen - seltener ist der Sommerroggen. Er ist ein Intensivwurzler, seine Wurzeln reichen bis 1 Meter tief. Bei einer frei stehenden Pflanze können die Wurzeln eine Länge von 80 m und die Wurzelhaare eine Oberfläche von 400 Quadratmetern erreichen. Niedergedrückte Halme können sich so schnell wieder aufrichten. Der Roggen ist eine Allergiepflanze: Roggenpollen gelten als die stärksten Allergieauslöser unter den heimischen Gräsern. Fruchtreife ist von Juli bis August. Die Zeit von der Samenkeimung bis zur Fruchtreife beträgt beim Winterroggen etwa 280 bis 320 Tage. Der Roggen wird am meisten von dem stark giftigen Mutterkornpilz befallen. Nach der Infektion der Blüten entsteht an der Stelle der Früchte ein langes, braunes, hartes Korn. Man hat an zwei Stellen in steinzeitlichen Schicken in Nordsyrien Roggenkörner gefunden. Ansonsten fehlen Hinweise auf die Nutzung von Roggen aber fast völlig, bis er in archäologischen Funden in Europa, die aus der Zeit von ca. 1800–1500 v. Chr. stammen, wieder erscheint. Die Zusammensetzung von Roggen schwankt naturgemäß, sowohl in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen (Boden, Klima) als auch von der Anbautechnik (Düngung, Pflanzenschutz). Angaben je 100 g essbarem Anteil: Mineralstoffe: Natrium 4 mg, Kalium 510 mg, Magnesium 90 mg, Calcium 35 mg, Mangan 2,9 mg, Eisen, 2,8 mg, Kupfer, 0,39 mg, Zink, 2,9 mg, Phospos 335 mg, Selen 0,002 mg Roggen enthält auch noch Vitamine wie Thiamin (Vit. B1), Riboflavin (Vit. B2), Nicotinsäure (Vit. B3), Phantothensäure (Vit. B5), Vitamin B6, Folsäure, Vitamin E und Aminosäuren wie Tryptophan, Threonin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Valin, Tyrosin, Arginin, … Aus Sicht der TCM, stärkt Roggen unseren Geist, vertreibt Nässe und unterstützt die Leberenergie.Er zählt zu den thermisch neutralen Lebensmitteln im Feuer-Element. Ein klassisches Rezept mit Roggen ist der Feuerfleck, eine alte Brotflade, die nur aus Wasser und Roggenmehl gemacht wird und dann mit Sauerrahm oder Knoblauchpaste gefüllt wird!                     Gerste ist sehr wertvoll für unsere Gesundheit, die thermische Wirkung ist erfrischend. Sie leitet Hitze aus und wird daher in der TCM bei Hautkrankheiten wie Neurodermitis verwendet. Wie Reis gleicht Gerste den Wasserhaushalt im Körper aus beruhigt die Schleimhäute im Magen- Darmbereich ist antioxidativ, also ein toller Radikalfänger senkt hohes Cholesterin sehr gut bei Völlegefühl oder Verdauungsschwäche (löst Nahrungsstagnation und harmonisiert die Mitte) tonisiert das Qi und wirkt blutaufbauend – ideal für Frauen und “Burn-Out”-Gefährdete. stärkt das Bindegewebe und kräftigt Haare und Nägel (hoher Eisen-, Zink- und Mangangehalt) Gerste hat einen innigen Bezug zu Kiesel (Kieselsäuren werden die Sauerstoffsäuren des Siliziums bezeichnet) und die Fähigkeit Malz zu bilden. Die Kieselsubstanz der Gerste kann im menschlichen Körper alles unterstützen, was einer Elastizität bedarf: die Außenhaut · die Schleimhäute in sämtlichen Bereichen · Bänder, Sehnen; · Zwischengewebe · Gelenke · die Bandscheiben der Wirbelsäule Ein langes Köcheln der Körner, das Kiesel herauslöst, erweist sich als günstige Zubereitung zur Vorbeugung bzw. Verbesserung bei Hautkrankheiten, Neurodermitis, Allergien sowie Bandscheibenschäden oder Gewebsschäden. Als Getränk, dem Gerstenwasser, kann diese Zubereitungsform dem Ermüdeten, dem Lungenkranken und allgemein dem Rekonvaleszenten empfohlen werden. Als Schleim zubereitet dem Magen- und Darmkranken. Die angekeimte und gedarrte (gemälzte) Gerste oder der Gerstenmalzextrakt wirken stärkend auf die Muskel- und die Denktätigkeit und sind daher hauptsächlich in der Kleinkind- und Jugendernährung einzusetzen. Gerste ist eines der wenigen Getreidesorten, die den Körper entsäuern kann und somit eine unschätzbare Hilfe um die Gesundheit zu erhalten und Krankheiten zu besiegen. Übersäuerung, die durch zu viel Stress, negative Emotionen und Ernährung mit Weißmehlprodukten und Fleisch entsteht, ist Ausgangspunkt für fast jede Erkrankung. Mit Gerste mache ich sehr gerne Gerstlsuppe, Graupotto - ein sommerliches Gerstenrisotto, Ritschert mit Gerste anstatt mit Reis und einen Gerstenflockenbrei mit Früchten zum Frühstück. Music by Lee MacDougall

Jasmonate sind Phytohormone mit vielfältiger Wirkung in Entwicklung und Stressmanagement der Pflanzen. Über die Perzeption und Transduktion der Jasmonatsignale ist bisher kaum etwas bekannt. Unter Verwendung des synthetischen Jasmonat-Analogons 6-Azido-1-oxoindanoyl(14C)isoleucinmethylester (IndAz(14C)IleMe) als Radioligand wurde eine spezifische Bindestelle in Sojabohne (Glycine max) biochemisch charakterisiert, in der Erwartung, eine Bindestelle für Jasmonate zu beschreiben. Die IndAz(14C)IleMe-Bindung erwies sich als spezifisch, saturierbar und reversibel. Da es sich aber um eine niedrigaffine Bindestelle handelt und die Affinität verschiedener Jasmonate und synthetischer Indanoyl-Isoleucin-Konjugate nicht mit deren biologischer Aktivität in Sojabohne korreliert, dürfte es sich bei der IndAz(14C)IleMe-Bindestelle nicht um einen Jasmonatrezeptor handeln. Sowohl bei Jasmonaten als auch bei Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten wurden Methylester gegenüber den entsprechenden freien Säuren bevorzugt gebunden. Ein Enzym, das den Liganden umsetzt, scheint nicht vorzuliegen, da die IndAz(14C)IleMe-Bindung kein pH-Optimum aufwies und keine Umsetzung des Liganden beobachtet wurde. Mit fortschreitendem Alter der Pflanze nahm die Bindungsaktivität zu. Die IndAz(14C)IleMe-Bindestelle kommt in verschiedenen höheren Pflanzenarten vor, war hauptsächlich in der Wurzel nachweisbar und wurde in der Zellwand lokalisiert. Da die Bindestelle weder mit Salzen noch mit Detergenzien extrahiert werden konnte, gegenüber Proteinase K, DTT, Periodat, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Pectinase und Pectolyase resistent und zu 50 % hitzestabil war, wird vermutet, dass ein in der Zellwand fest verankertes Protein vorliegt. Zu den intrazellulären Signalvermittlern von Pflanzen gehört Calcium, nicht nur im Cytosol, sondern auch im Zellkern. In transgenen Nicotiana tabacum BY-2-Zellen wurden mit Hilfe des Photoproteins Aequorin erstmals jasmonatinduzierte Änderungen der Calciumkonzentration in beiden Kompartimenten gezeigt. Auch ein Vertreter aus der Gruppe der Phytoprostane, Phytoprostan B1 Typ II, löste Calciumantworten in Cytosol und Zellkern aus. JA und OPDA induzierten unterschiedliche Calciumsignaturen, die sich jeweils aus einer cytosolischen Calciumantwort gefolgt von einem Calciumsignal im Zellkern zusammensetzten. Die Unterschiede in Form, Höhe und Kinetik der einzelnen Antworten lassen auf zwei verschiedene Signaltransduktionswege bei JA und OPDA schließen. MeJA war in beiden Kompartimenten inaktiv und demonstriert dadurch, dass MeJA nicht immer, wie häufig angenommen wird, wie JA wirkt. Durch das Isoleucin-Konjugat der JA (JA-Ile) wurde eine dritte Calciumsignatur ausgelöst, die sich von der JA-induzierten Calciumsignatur durch das Fehlen der JA-ähnlichen cytosolischen Calciumantwort unterscheidet. Dieser Befund lässt vermuten, dass die Unterscheidung von JA- und JA-Ile-Signalen möglicherweise auf Ebene des Calciums stattfindet. Eine Struktur-Aktivitätsanalyse mit Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten bestätigte, dass die Konjugation mit Isoleucin zur Veränderung der Calciumsignatur führt. Die unkonjugierte 1-Oxoindan-4-carbonsäure (Ind) verhielt sich wie JA, das Konjugat Ind-Ile wie JA-Ile. Ferner wurde gezeigt, dass für die Induktion der Calciumantworten eine freie, negativ geladene Carboxylgruppe unerlässlich ist. Neben MeJA erwiesen sich JA-IleMe, Ind-IleMe und 3-(Nitro-methyl)-2-((Z)-pent-2-enyl)cyclopentanon als inaktiv. 6-substituierte Indanoyl-Isoleucin-Konjugate zeichnen sich durch verstärkte biologische Aktivität aus. Tatsächlich verlieh der Ethyl-Substituent dem IndEt-IleMe calciuminduzierende Aktivität im Zellkern. Bei den freien Säuren Ind-Ile und IndEt-Ile wurde aber keine Aktivitätssteigerung durch Substitution festgestellt. Die Untersuchung der Expression einiger JA-responsiver Gene zeigte, dass unter den Versuchsbedingungen, die die Induktion von Calciumantworten ermöglichten, keine jasmonatinduzierte Genexpression erfolgte. Sollten die beschriebenen Calciumsignale die Expression bestimmter Gene vermitteln, ist eine ausgewählte Gruppe von Genen zu erwarten, deren Expression eventuell einen besonderen physiologischen Zustand der Zellen erfordert.

Respiratory syncytial virus (RSV) is recognised as the most frequent cause of severe lung infections in infants and cattle worldwide. Currently, no effective treatments are available and the development of a successful vaccine has been hampered by the fact that natural infection does not provide complete and durable protection. RSV nonstructural proteins, NS1 and NS2, are strong inhibitors of IFN α/β-production by specifically preventing interferon regulatory factor (IRF)-3 phosphorylation. However, the exact mechanisms leading to NS protein-mediated inhibition of IRF3 remain to be unravelled. One of the objectives of this study was to identify amino acid domains in the human respiratory syncytial virus (HRSV) nonstructural proteins (NS) responsible for their ability to ablate the IFN-β signalling pathway. Furthermore, I wanted to find out at which level of this signalling pathway the NS proteins exert their suppressive activity and which are their major cellular targets. HRSV strains A2 and Long differ in their ability to block interferon type I synthesis. Sequence analysis of their NS proteins revealed the presence of an amino acid residue in the NS2 protein with a potential role for RSV IFN-inhibitory functions. Two recombinant bovine respiratory syncytial (BRSV) viruses harbouring HRSV NS1 and NS2 genes were generated and tested in their ability to restrict IFN-β synthesis. These recombinant viruses differed only in the identity of the residue at position 26 of the HRSV NS2 protein: rBRSVh1/2 has a Threonine as in the Long strain, while in rBRS h1/2*T26I this amino acid was mutated into an Isoleucin similarly to A2 virus. Sets of in vitro tests revealed that IFN-β induction was impaired by rBRSVh1/2*T26I when compared to rBRSV h1/2. Analysis of the transcriptional factors (AP-1, NF-kB and IRF3) involved in the activation of IFN-β synthesis provided evidence that the inhibitory ability of rBRSVh1/2*T26I was correlated to a selective block of IRF3. The mutation (T26I) in the NS2 protein did neither effect the NF-kB activation pathway nor perturbed the IFN-resistance characteristics of the chimeric viruses. IRF3 is activated upon phosphorylation mediated by IKK-related kinases (TBK1 and IKK-ε). TBK1 was therefore cloned from a human lung cDNA library and its biological activities regarding the induction of IFN-β were compared in mock-infected and infected cells. rBRSVh1/2*T26I and HRSV A2 precluded virus-induced IRF3 activation by interfering with TBK1 functions. No direct interaction between TBK1 and NS2 protein was demonstrated indicating that the kinase TBK1 may not be the sole target involved in RSV mechanisms of evasion of the innate immune response. Recombinant IFN-inducible rabies viruses expressing HRSV Long-derived (rGFP-Ph2/1) or HRSV A2-like (rGFP-Ph2*T26I/1) NS proteins were also generated. The HRSV NS2 protein expressing an Isoleucin (NS2*T26I) at position 26 was not able to suppress IFN-β induction and to rescue the growth of the recombinant eGFP-Ph2*T26I/1 in interferon-competent cells. A low expression of the mutated NS2*T26I protein was probably the reason of this failure. In summary, these results show that the HRSV NS2 protein possesses an intrinsic IFN-β inhibitory activity, which is achieved throughout a selective inhibition of the IRF3 activation pathway. The block appears to be exerted at the level of IRF3-kinase TBK1. Interferonantagonist functions of the HRSV NS2 protein are linked to a particular amino acid motif in the N-terminus of the protein. Identification of this amino acid domain and of TBK1 as the cellular target provide a better insight of how the HRSV NS2 protein prevents the establishment of the antiviral innate immune response and therefore it might contribute to the development of an effective vaccine.

Ziel dieser Arbeit sollte die Entwicklung einer automatisierten, hochparallelen und nachweis-starken Sequenzierungsmethode für Proteine im Rahmen der Proteomanalytik sein. Zur Kon-zeption der Methodik sollte dabei mit der sogenannten Leitersequenzierung eine Kopplung aus enzymatischem Aminosäureabbau und MALDI-Massenspektrometrie zum Einsatz kom-men. Die experimentellen Grundparameter für die Leitersequenzierung im Bezug auf die nasschemischen Sequenzierungsschritte und die massenspektrometrischen Messung wurden dabei im ersten Teil der Arbeit zunächst manuell ausgearbeitet. Im zweiten Abschnitt wurden dann die Möglichkeiten einer Automatisierung der so erarbeiteten Methode zur Leitersequen-zierung auf verschiedenen Ebenen evaluiert. Da der enzymatische Abbau eines Gesamtproteins durch dessen intrinsische Eigenschaften wie Sekundärstruktur, Tertiärstruktur (Zugänglichkeit der Proteintermini für die Exopepti-dase) oder Lösungsverhalten erschwert ist, wurden die Sequenzierungsprotokolle der Leiter-sequenzierung für proteolytisch erzeugte, RP-HPLC-gereinigte Spaltfragmente von Proteinen optimiert. Zudem besitzt die MALDI-MS, wie auch andere gängige massenspektrometrische Verfahren, im Massenbereich über ca. 5-10 kDa eine zu geringe Auflösung und Genauigkeit, um eine eindeutige Zuordnung der Massendifferenzen in den Leiterpeptidspektren zu den durch Exopeptidase abgespaltenen Aminosäure zu erlauben. Bei Versuchen mit verschiede-nen Endopeptidasen stellte sich – entgegen theoretischen Erwartungen – heraus, dass vor allem auch Proteinspaltungen mit Endoproteinase GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin, neben Spaltungen mit Endoproteinase LysC, gute Voraussetzungen für die nachfolgende enzymatische Sequenzierung liefern. Mit den Proteinfragmenten aus Spaltungen der Endoproteinasen GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin wurden bei den enzymatischen Sequenzierungen die höchsten Sequenzabdeckungen erzielt. In der technischen Ausführung wurden alle Experimente im Hinblick auf eine Sequenzierung direkt auf dem Target (on-target) optimiert. Geringfügige Anpassungen der erarbeiteten Methoden erlaubten jedoch auch eine Sequenzierung von Peptiden, die zuvor auf PVDF-Membran (Immobilon PSQ) aufgetragen wurden. Ein relativ kontrollierter und reproduzierba-rer Abbau war in einem Temperaturbereich von ca. 25-35°C möglich. Die enzymatischen Sequenzierungen erfolgten ausschließlich mit kommerziell erhältlichen Exopeptidasepräpara-tionen. Eine zusätzliche Aufreinigung der eingesetzten Enzyme erwies sich als nicht notwen-dig. Um eine einfache Interpretation der massenspektrometrischen Resultate zu gewährleisten, wurden nur Monopeptidylpeptidasen eingesetzt. Für C-terminale Sequenzierungen wurden mit CPY, CPP, CPW, CPA und CPB Carboxypeptidasen unterschiedlicher Spezifität einzeln und in verschiedenen Kombinationen untersucht. Von der N-terminal Seite aus wurden Sequenzierungen mit APM, LAP, API und AAP durchgeführt. Eine Betrachtung der Sequen-zierungen zeigt dabei, dass zumeist nur aus kombinierten Resultaten der Anwendung verschiedener Carboxy- beziehungsweise Aminopeptidasen eine ausreichende Sequenzinfor-mation erhalten werden kann. C-terminal ist der Anteil sequenzliefernder Fragmente bei der Verwendung von CPY, sowie bei den sequenziellen Peptidasenkombinationen sb(CP-I) und den Peptidasenmischungen pb(CP) mit maximal 42% am höchsten. Hier treten auch vermehrt längere Teilsequenzen mit bis zu 12 AS auf. N-terminal hebt sich APM als Einzelpeptidase mit überdurchschnittlich guten Sequenzresultaten gegenüber den anderen Aminopeptidasen ab. Bis zu 34% der getes-teten Peptide liefern allein schon mit diesem Enzym eine Sequenzinformation. Zudem wurden längere Teilsequenzen mit bis zu 9 AS im Vergleich zu anderen Aminopeptidasen häufiger erhalten. Sequenzierungen mit Aminopeptidasenmischungen bei N-terminaler Sequenzierung brachten im Gegensatz zu Carboxypeptidasenmischungen bei C-terminaler Sequenzierung kaum deutliche Vorteile. Auch sehr lange Sequenzabschnitte mit bis zu 16 AS N-terminal und bis zu 25 AS C-terminal wurden in Einzelfällen erhalten. C- und N-terminal am häufigsten wurden jedoch aus den Leiterspektren Teilsequenzen mit bis zu 6 AS erhalten (85% aller sequenzliefernden Proteinfragmente). Der größte Teil der Sequenzabdeckung stammt mit 70% aus Teilsequenzen mit 3-9 AS. Unter dem Hauptaspekt einer möglichen Steigerung der Sequenzinformation bei den Leiter-sequenzierung wurden unterschiedliche Peptidderivatisierungen untersucht. Die gezielte N-terminale Modifizierungen brachte in vielen Fällen durch die resultierende Massenverschie-bung des derivatisierten Peptids einen Gewinn an C-terminaler Sequenzinformation. Gegen-über entsprechend nicht-modifizierten Peptiden konnten durch die Massenverschiebung auch Leiterpeptide beobachtet werden, die sonst mit Signalen der MALDI-Matrix interferieren. Bei Modifikationsreagenzien, die eine fixierte positive Ladung oder ein ausgedehntes, delokali-siertes Elektronensystem ins Peptid einbrachten, wie z.B. Sulforhodamin B oder FMOC-NHS wurde dabei zusätzlich auch eine sehr gute Response im Massenspektrum beobachtet. Die Empfindlichkeiten lagen selbst bei der Sequenzierung der Rohprodukte solcher Derivate im unteren fmol-Bereich. Das charakteristische Isotopenmuster Brom-haltiger Peptidderivate erlaubte weiterhin ein stark vereinfachtes Auslesen der Leitersequenz aus dem Massenspekt-rum. Während die Leitersequenzierung allgemein keine Unterscheidung der isobaren Aminosäuren Leucin und Isoleucin erlaubt, gelang die Unterscheidung der ebenfalls isobaren Aminosäuren Lysin und Glutamin nach einer schnellen und selektiven Acetylierung des Lysins mit anschließender C-terminaler Sequenzierung.Im Hinblick auf die Analyse post-translationaler Modifikationen wurden insbesondere Phosphorylierungen eingehender untersucht. Dabei war sowohl bei der N-terminalen, als auch bei der C-terminalen Leitersequenzierung ein enzymatischer Abbau der phosphorylierten Aminosäuren zu beobachten und damit die entsprechende Phosphorylierungsstelle schnell und eindeutig zu identifizieren. Die N-terminale Sequenzierung mit APM lieferte die besten Resultate und ermöglichte sowohl den Abbau von Phosphotyrosin wie auch Phosphoserin, während der C-terminale Abbau sich auf Phosphotyrosin beschränkt zeigte. Aus der Summe der erhaltenen Resultate (Sequenzen) folgt, dass die Leitersequenzierung unter den gegebenen Voraussetzungen – insbesondere der limitierenden Verfügbarkeit zusätzlicher Exopeptidasen mit ergänzenden Spaltungsspezifitäten – im wesentlichen als Instrument zur schnellen Generierung kurzer Sequenztags geeignet ist. Auf diesem Gebiet stellt die erarbeitete Leitersequenzierung im Vergleich zur Edman-Sequenzierung eine wesentlich schnellere Alternative dar. Im Gegensatz zu rein massenspektrometrischen Sequenzierungen ist die Interpretation der Sequenzen im Massenspektrum stark vereinfacht und daher zumeist eindeutig. Die Empfindlichkeit der Methode ist stark von der untersuchten Peptidsequenz abhängig. Generelle Werte für die Empfindlichkeit lassen sich somit nicht angeben, die Resultate lassen jedoch für eine Peptidausgangsmenge im oberen fmol-Bereich (1000-500fmol) eine Leitersequenzierung ausnahmslos möglich erscheinen. Die Ergebnisse von Verdünnungsreihen zeigen zudem, dass auch nach Sequenzierung von Peptidmengen im mittleren bis unteren fmol-Bereich (50-10fmol) ein Auslesen der Peptidsequenz aus dem Massenspektrum zumeist möglich ist. Zum Erreichen solcher Empfindlichkeiten ist die weit-gehende Minimierung von Suppressionseffekten und damit die Verwendung von DHB als MALDI-Matrix eine notwendige Voraussetzung. Eine Evaluierungsstudie mit vier verschiedenen Proteinen führt zum Schluss, dass die Metho-dik auch für die de novo Sequenzierung unbekannter Proteine ein hohes Potential birgt. Die ermittelte Sequenzabdeckung der überlappenden Spaltfragmente lag bei maximal 80%. Im Bereich prolinhaltiger Sequenzabschnitte fehlen Überlappungen dabei am häufigsten, da auf Seiten der N-terminalen Sequenzierung geeignete Exopeptidasen zu Spaltung der Iminbindung nicht verfügbar waren. Zur Herstellung von Oligonucleotidsequenzen, die dann als Hybridisierungssonden in der Nucleinsäureanalytik eingesetzt werden, ist die Länge der erhaltenen Sequenzabschnitte jedoch in fast allen Fällen ausreichend. Die Methoden „MALDI-LS 1.42s“ für die Probenpräparation mit dem Pipettierroboter MultiPROBE II, sowie „multiprobe_5“ für die MALDI-MS Messung mittels AutoXecute auf dem Bruker Reflex III Massenspektrometer, erlauben eine Umsetzung der manuell ausgear-beiteten Methodik auf ein vollständig automatisiertes System. Eine Excel-Tabellenvorlage, die in konvertierter Form von beiden beteiligten Geräten gelesen werden kann, ermöglicht eine zentrale und einfache Dateneingabe für die Proben. Diese Art der Dateneingabe erlaubt im Zusammenspiel mit dem ausgearbeitetem Automatisierungspro-gramm eine vollkommen flexible, individuelle Behandlung der einzelnen Proben. Die erfor-derliche „Ortspräzision“ bei der Abgabe der Flüssigleiten auf dem MALDI-Target konnte durch eine entsprechenden ausgelegte Performance-Datei für den Pipettiervorgang erreicht werden. Querkontaminationen beim Pipettieren wurden durch organische Spülschritte in der Methode eliminiert. In der Summe lieferten die auf dem automatischen Pipettiersystem mit der Methode MALDI-LS 1.42s präparierten Proben im Massenspektrum vergleichbare Abbauspektren und somit auch die gleiche Sequenzinformation, wie entsprechend manuell präparierte Proben. Bei den automatischen MALDI-MS Messungen war eine Anpassung der Parameter insbeson-dere aufgrund der bevorzugten Verwendung der DHB-Matrix notwendig. Ein erhöhter Aceto-nitrilgehalt von 50% im Lösungsmittel der DHB sorgte für eine Verbesserung der Präparation im Bezug auf die automatische AutoXecute Messung. Mit speziellen Rasterkoordinaten, die bei der Laserabtastung der einzelnen Probenspots auf die besonderen Kristallisationseigen-schaften der DHB-Matrix zugeschnitten wurden, konnten gute Ergebnisse erzielt werden. Vorteile zeigten die DHB-Präparationen, im Vergleich zu CHCA-Präparationen, in der Toleranz gegenüber geringfügigen Mengen von Puffersalzen, wie sie bei der enzymatischen Sequenzierung üblich sind. Die Toleranzschwelle für den Abbruch der automatischen Messung musste jedoch bei den enzymatisch sequenzierten Proben und Verwendung von DHB-Matrix im Vergleich zu Messungen salzfreier Peptidproben in CHCA-Matrix erhöht werden, was im Durchschnitt zu etwas längeren Messzeiten führte. Die in dieser Arbeit weiterentwickelten Methoden zur enzymatischen on-target Sequenzie-rung von Peptiden erlauben somit, in Verbindung mit den beschriebenen Hard- und Software-komponenten zur automatischen Probenpräparation und MALDI-MS Messung, deren Einsatz für eine schnelle Sequenzierung in der Proteinanalytik. Zusätzliche Verbesserungen könnten jedoch, bei entsprechender Verfügbarkeit, noch durch Exopeptidasen mit ergänzender Spaltungsspezifität (z.B. X-Pro Aminopeptidase, EC 3.4.11.9) erzielt werden. Auf Seiten der Automatisierung ergäben sich durch die ausschließliche Ver-wendung eines 96er oder 384er Mikrotiterplattenformat auf allen Geräten (Pipettierrobot und MALDI-MS) deutliche Vereinfachungen in der Methode, bei gleichzeitig noch höherem Probendurchsatz.