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Sportstunde - Das Podcast-Sportmagazin
kleine Bälle, große Bälle, orange Bälle und asiatisches Allerlei

Sportstunde - Das Podcast-Sportmagazin

Play Episode Listen Later Sep 20, 2023 67:00


In Folge 5 gibt es folgende Top-Themen: - Tennis: Rückblick auf den Davis-Cup in Mostar mit dem Davis Cup-Teamchef Michael Kohlmann - Tischtennis: Rückblick auf die Tischtennis-EM (Teamwettbewerb) mit Jörg Roßkopf (Bundestrainer Männer) - Basketball: : was bedeutet der Weltmeister-Titel für die Vereine? Interview Benka Barloschky (Head Coach Hamburg Towers) - Basketball: Wer ist Dennis Schröder? Sein Manager Marcus Höfl gibt Antworten. - Asienspiele: was passiert in Asien? Sportjournalist Arunava Chanduri klärt uns auf. - Sportbuch: Thema "Marathon" (www.sprengerspricht.de) Hier die Interviews in Volllänge: RSS-Feed: https://sportstunde.podcaster.de/interviews-in-voller-langer.rss podcast.de: https://www.podcast.de/podcast/3313048/sportstunde-interviews-in-voller-l%C3%A4nger Spotify: https://open.spotify.com/show/00va1TW4YzTYDCGMpkNMOU Apple Podcast: COMING SOON

Sportstunde - Das Podcast-Sportmagazin
Es geht aufs Eis, auf die Matte, durch den Korb und ins Netz...

Sportstunde - Das Podcast-Sportmagazin

Play Episode Listen Later Sep 13, 2023 63:10


In Folge 4 gibt es folgende Top-Themen: - Basketball: Rückblick auf die Basketball-WM mit dem ehemaligen Bundestrainer Henrik Rödl - Fussball: Ausblick auf das Topspiel der Fußball-Bundesliga FC Bayern München gegen Bayer Leverkusen mit Jens Nowotny (336 Bundesliga-Spiele) - Ringen: Ausblick auf die Ringen-WM in Belgrad mit dem zweimaligen Weltmeister Alexander Leipold - Eishockey: Ausblick auf die neue DEL-Saison mt dem ehemaligen Eishockeyspieler Christoph "Ulle" Ullmann - Sportbuch: Biographie über den. ehemaligen Eishockeyspieler Andreas "Andi" Renz (www.sprengerspricht.de) - Fussball: Marcus Höfl mit den Fakten zur Saudi Pro League Hier die Interviews in Volllänge: RSS-Feed: https://sportstunde.podcaster.de/interviews-in-voller-langer.rss podcast.de: https://www.podcast.de/podcast/3313048/sportstunde-interviews-in-voller-l%C3%A4nger Spotify: https://open.spotify.com/show/00va1TW4YzTYDCGMpkNMOU Apple Podcast: COMING SOON

Sportstunde - Das Podcast-Sportmagazin
Springreiten, große und kleine Eier Rekorden, unfassbares und ein bisschen Fussball.

Sportstunde - Das Podcast-Sportmagazin

Play Episode Listen Later Sep 6, 2023 57:45


Auch diesmal ist die „Sportstunde“ prall gefüllt. Wir sprechen mit Christian Kukuk über die Springreiter-EM, Andreas Nommsen nimmt uns mit auf eine Reise von den Playoffs der ELF in sonnige Florida, Jan Lüdeke erklärt uns das eine der größten periodischen Sportereignisse der Welt, wir sprechen über ein royales Thema mit Stefan Huss und Thomas Helmer spricht mit und natürlich über Fussball. Bei all dem kommen aber auch der Sportflash, Tops und Flops und unter Literatur Tipp nicht zu kurz. zu Gast;: Jan Lüdeke zu Rugby, Thomas Helmer, Andreas Nommensen, Invictus Games, Christian Kukuk, Marcus Höfl. Hier die Interviews in Volllänge: RSS-Feed: https://sportstunde.podcaster.de/interviews-in-voller-langer.rss podcast.de: https://www.podcast.de/podcast/3313048/sportstunde-interviews-in-voller-l%C3%A4nger Spotify: https://open.spotify.com/show/00va1TW4YzTYDCGMpkNMOU Apple Podcast: COMING SOON

El Trip Del Fantasy
ETDF 2.0 Sesión 2

El Trip Del Fantasy

Play Episode Listen Later Sep 6, 2023 71:21


Acompañenos a este segundo capitulo del trip del fantasy VOLll. En este capítulo hablaremos de nuestros 3 de 3 faltantes para la temporada que ya arranca este jueves. También tocaremos algunas noticias y unas buenas estrategias que nos han servido en nuestros drafts. #MasFantasy #MasTrip

Versicherungsplauderei
F7 - Wir zahlen, wenn Dein Keller vollläuft. Der Extremwetterschutz.

Versicherungsplauderei

Play Episode Listen Later Jul 5, 2022 13:52


Stürmt und regnet es wirklich öfter als früher? Oder fühlt sich das nur so an im Klimawandel? Wenn mein Keller unter Wasser steht oder noch extremer - Wenn mein Haus zerstört wird durch Extremwetter - bleib ich dann auf dem Schaden sitzen und muss auf staatliche Hilfe hoffen? Oder kann ich mich dagegen versichern? Mehr Infos gibt es hier: https://www.allianz.de/recht-und-eigentum/wohngebaeudeversicherung/extremwetterschutz/

VEMA-Podcast
Folge 6 - Elementarschäden - wenn der Keller vollläuft...

VEMA-Podcast

Play Episode Listen Later Oct 1, 2021 18:57


Wenn das Licht ausgeht, man die Sicherung im Keller wieder reinmachen will und plötzlich knietief im Wasser steht, hat man mit ziemlicher Sicherheit einen Elementarschaden. Jedenfalls berichtet Milena Kalb-Aytekin von genau so einem Horrorerlebnis im eigenen Haus. Wie man sich in so einer Situation richtig verhält, was Versicherungsnehmer im Vorfeld unbedingt beachten sollten, welche Unterstützung die VEMA im Schadenfall bietet und noch vieles mehr zum Thema Elementarschadenversicherung erfahrt Ihr in dieser Folge des VEMA-Podcast.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19
Anti-Agrin-Autoantikörper in Seren von Myasthenia gravis Patienten

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19

Play Episode Listen Later Oct 8, 2015


Myasthenia gravis (MG) ist eine neuromuskuläre Erkrankung mit einer Inzidenz von etwa 20-30/1 000 000 Menschen. Die Erkrankung führt zu einer Störung der synaptischen Erregungsübertragung an der neuromuskulären Endplatte und damit zu einer zunehmenden Schwäche der Muskulatur. In etwa 80 bis 90 Prozent der Patienten mit Myasthenia gravis konnten Autoantikörper gegen den Azetylcholinrezeptor nachgewiesen werden, die für die Symptome verantwortlich sind. In den letzten Jahren wurden bei einigen Myasthenia gravis Patienten Autoantikörper gegen die muskelspezifische Rezeptor-Tyrosinkinase (MuSK) und LRP4 (lipoprotein receptor-related protein) nachgewiesen. Allerdings gibt es immer noch eine geringe Anzahl von Myasthenia gravis Patienten, bei denen noch kein für die Beschwerden ursächlicher Antikörper gefunden werden konnte. Agrin ist neben LRP4 und MuSK ein weiteres Protein an der neuromuskulären Endplatte, und ist gemeinsam mit den beiden anderen Proteinen für die Bildung und Aufrechterhaltung der für die Erregungsübertragung notwendigen Aggregation von Azetylcholinrezeptoren verantwortlich. Deshalb liegt die Vermutung nahe, dass auch Autoantikörper gegen Agrin zu einer Beeinträchtigung der neuromuskulären Übertragung führen könnten. Auf dieser Hypothese beruht die vorliegende Studie, in der Seren von 54 Patienten mit klinisch diagnostizierter Myasthenia gravis auf das Vorhandensein von anti-Agrin-Antikörpern untersucht wurden. 30 der 54 untersuchten Seren waren seronegativ für Antikörper gegen den Azetylcholinrezeptor und MuSK, 15 Proben hatten erhöhte Konzentrationen an Antikörpern gegen MuSK und 9 davon waren seropositiv für anti-Azetylcholinrezeptor-Antikörper. Als Kontrollgruppe fungierten die Seren von 16 gesunden Probanden. Anstelle von Volllängen-Agrin wurde in den Experimenten mini-Agrin verwendet – ein synthetisches Protein, welches etwa 50 Prozent der Sequenz von Agrin enthält. Der Nachweis der Autoantikörper erfolgte mittels zweier unterschiedlicher Methoden: einem ELISA mit gereinigtem mini-Agrin und immunhistochemischen Färbungen von mit humanem mini-Agrin transfizierten HEK293 Zellen. Durch den ELISA gelang außerdem die Bestimmung der Antikörperkonzentrationen der detektierten anti-Agrin-Antikörper. In fünf der 54 untersuchten Seren konnten im ELISA erhöhte Konzentrationen an anti-Agrin-Antikörpern nachgewiesen werden. Die Antikörperkonzentrationen lagen zwischen 0,04 und 0,12 nM. Zwei dieser fünf Seren färbten spezifisch mit mini-Agrin transfizierte Zellen an, drei davon zeigten eine spezifische Färbung der neuromuskulären Endplatten in Mausgewebe. In vier der anti-Agrin-Antikörper-positiven Seren waren zuvor Antikörper gegen MuSK nachgewiesen worden; eines der Seren war anti-Azetylcholinrezeptor-Antikörper-positiv und zwei Seren hatten erhöhte Konzentrationen an Antikörpern gegen LRP4. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie belegen das Vorhandensein von Antikörpern gegen Agrin in Patienten mit klinisch diagnostizierter Myasthenia gravis und geben damit Hinweise auf Agrin als ein neues Antigen in der Pathogenese der Erkrankung. In allen fünf der anti-Agrin-Antikörper-positiven Seren waren zuvor Antikörper gegen MuSK, LRP4 oder den Acetylcholinrezeptor nachgewiesen worden. Dies weist auf eine hohe Koinzidenz von Antikörpern gegen unterschiedliche Proteine der neuromuskulären Endplatte in Patienten mit Myasthenia gravis hin. Insbesondere konnten in dieser Studie zum ersten Mal drei Autoantikörper gegen Proteine der neuromuskulären Endplatte in einem Serum nachgewiesen werden. Inwiefern anti-Agrin-Antikörper an der Entstehung der für die Erkrankung typischen Veränderungen der Muskulatur beteiligt sind, bleibt weiterhin unklar und könnte Gegenstand zukünftiger Studien sein.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
RNA-Seq-basierte Isolierung des Resistenzgens Bs4C aus Paprika

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06

Play Episode Listen Later Apr 13, 2015


Das Paprika Resistenzgen Bs4C aus Capsicum pubescens vermittelt Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)-Stämmen, die den (transcription activator-like) TAL-Effektor AvrBs4 exprimieren. Vorangegangene Arbeiten ließen vermuten, dass AvrBs4 die Expression von Bs4C transkriptionell induziert. In einem “proof of principle”-Experiment, wurde Bs4C unter Verwendung eines RNA-Seq-basierten Ansatzes isoliert. Unter 68 differentiell AvrBs4-induzierten Paprikagenen war jedoch nur eines, das ausschließlich in der resistenten und nicht in der suszeptiblen Akzession induziert war und für das kein Transkript in Abwesenheit von AvrBs4 in der resistenten Akzession nachgewiesen wurde. Kopplungs- und Komplementationsanalysen bestätigten dieses Kandidatengen als das gesuchte Resistenzgen Bs4C. Im Bs4C-Promoter konnte ein Effektorbindeelement (EBE) für AvrBs4 identifiziert werden, das notwendig und ausreichend für die AvrBs4-Bindung an und transkriptionelle Aktivierung von Bs4C ist. Bindungsstudien ließen erkennen, dass zwei Nukleotidpolymorphismen in der korrespondierenden Region der suszeptiblen Akzession eine stark reduzierte Affinität (10fach) gegenüber AvrBs4 bedingen. Außerdem zeigten GUS-Studien, dass der Promoter des suszeptiblen Allels nicht durch AvrBs4 induzierbar ist. Folglich bestimmt ein Substitutionspolymorphismus von zwei Basenpaaren in den Promotoren des resistenten und suszeptiblen Bs4C-Allels über Resistenz oder Suszeptibilität gegenüber AvrBs4-exprimierenden Xanthomonaden. Bs4C kodiert für ein 164-AS großes Protein, das keine Homologie zu Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. In silico Proteinstrukturanalysen sagen vier Transmembranhelices in Bs4C vorher und demzufolge stellt es einen neuen Typ von Exekutorproteinen dar, welcher Resistenz gegen TALE-exprimierende Xanthomonas-Stämme vermittelt. Zudem konnten Sequenzanalysen mindestens ein Homolog in C. pubescens und mindestens sieben Homologe in C. annuum identifizieren. Interessanterweise kodieren die meisten von ihnen aufgrund von Nukleotidaustauschen, Leserahmenverschiebungen und Insertions/Deletionspolymorphismen nicht für Volllängen Bs4C-ähnliche Proteine. Folglich könnten diese homologen Sequenzen duplizierte Gene repräsentieren, die nicht mehr funktional sind.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19
Aufbau eines Systems zur Untersuchung peroxisomaler Protein-Protein-Interaktionen in der lebenden Zelle mittels Biolumineszenz Resonanzenergietransfer

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19

Play Episode Listen Later May 15, 2014


Proteine werden durch Gene kodiert und sind die Vermittler biologischer Strukturen und Prozesse. Veränderungen der Gene haben einen Einfluss auf die Struktur und Funktion der Proteine. Zur Erfüllung ihrer Aufgaben bilden Proteine über Protein-Protein-Interaktionen (PPI) Komplexe oder Funktionseinheiten. Diese zu kennen, ist wesentlich für das Verständnis der Funktion einzelner Proteine im Gesamtkontext und um den Einfluss von genetischer Variation auf die Proteinfunktion im Rahmen angeborener Erkrankungen besser einordnen zu können. Bislang werden PPI einerseits v.a. mit Hochdurchsatz-Verfahren untersucht, bei welchen die Proteine nicht in ihrer biologischen Umgebung exprimiert oder in denaturierter Form verwendet werden; dadurch ist häufig mit Artefakten zu rechnen. Andererseits erfordern die Verfahren zur in vivo-Untersuchung biologisch relevanter Interaktionen einen hohen Aufwand. Wir beschreiben in dieser Arbeit den Aufbau und die Etablierung eines Verfahrens zur in vivo Hochdurchsatz-Untersuchung von PPI. Dieses beruht auf der Technologie des Biolumineszenz Resonanzenergietransfers (BRET), welche durch Optimierung des Prozesses zu improved BRET (iBRET) hinsichtlich Effizienz, Durchsatz und Validität verbessert wurde. Dabei wurde die Konstrukt-Klonierung durch Einsatz eines auf Rekombination basierenden Klonierungssystems beschleunigt und Effizienz sowie Durchsatz der Transfektion von eukaryonten Zellen mit Hilfe eines Elektroporationsverfahrens im 96-Well Format optimiert. Bei der Detektion wurde ein Substrat verwendet, welches nur von lebenden Zellen verarbeitet werden kann. Die Signalmessungen erfolgten automatisiert an einem Multiwell Plattenlesegerät. Die Auswertung wurde durch eine bioinformatische Methode zur Berechnung von Schwellenwerten für positive Interaktionen verbessert. Mit dieser Technologie konnte die Homodimerisierung von PEX26 erstmals beschrieben und charakterisiert werden. PEX26 ist ein Membranprotein des Peroxisoms, das am Import von Matrixporteinen in das Peroxisom beteiligt ist. Bei genetischen PEX26-Defekten kommt es zum Auftreten von sog. peroxisomal ghosts – dies sind Membrankompartimente ohne Matrixinhalt. Klinisch kommt es v.a. zu Erkrankungen aus dem Zellweger-Spektrum, die sich mit einem unterschiedlichen Schweregrad manifestieren. Anhand von Trunkierungs-Konstrukten identifizierten wir mittels iBRET die zwei Interaktionsdomänen für die Homodimerisierung am C-Terminus des Proteins in der Umgebung der Transmembrandomäne bzw. in der peroxisomalen Matrix. Diese liegen abseits der für den Matrixprotein-Import essentiellen Bindedomäne für PEX6, der sich im zum Zytosol gerichteten N-terminalen Abschnitt von PEX26 befindet. Neben dem Volllängeprotein PEX26 wurde auch die Splice-Variante PEX26Δex5 beschrieben, welcher das Exon 5 und damit die Transmembrandomäne fehlt. Diese Variante ist im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und im Zytoplasma lokalisiert. Wir zeigten, dass auch sie Homodimere bildet und zudem das Volllängeprotein PEX26 bindet. Sie ist in der Lage, das Fehlen von funktionellem PEX26 in PEX26-Defektzelllinien zu etwa 50% zu komplementieren, obwohl das Protein nicht am Peroxisom lokalisiert ist. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass sich PEX26 für den Matrixprotein-Import nicht zwingend am Peroxisom befinden muss. Die physiologische Funktion der Splice-Variante ist noch nicht aufgeklärt. Mittlerweile ist bekannt, dass auch PEX26 anteilig im ER lokalisiert ist und es mehren sich die Hinweise, dass es aufgrund der Herkunft der Peroxisomen aus dem ER bei deren Biogenese und Homöostase eine Rolle spielt. Wir führten eine Literaturrecherche nach Interaktionspartnern von PEX26 und seinem homologen Protein Pex15p aus der Hefe durch, fanden hier jedoch keinen Hinweis auf weitere Funktionsbereiche von PEX26. Klar ist jedoch, dass sich die unterschiedliche Manifestation der Defekte bei den Patienten nicht allein aus seiner Rolle beim Import von Matrixporteinen ableiten lässt. Basierend auf der vorliegenden Arbeit könnten Erkenntnisse aus der derzeit in unserer Arbeitsgruppe umgesetzten Untersuchung des peroxisomalen Interaktoms zu einem besseren Verständnis der Funktion von PEX26 und der Fehlfunktion bei PEX26-Defekt beitragen.

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/07
Zum Vorkommen von Prion Proteinen in der Milchdrüse und der Milch von Hauswiederkäuern

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/07

Play Episode Listen Later Feb 8, 2008


Die vorliegende Arbeit untersuchte im ersten Teil tierart-vergleichend das Vorkommen von PrPC bei Hauswiederkäuern in Eutergewebe und in den verschiedenen Milchfraktionen. Dies erfolgte mittels EIA und Western-Blot sowie für das Eutergewebe auch mittels Immunhistochemie (IHC). Für die Aufarbeitung von Rahm wurde dabei ein neues Verfahren etabliert, durch das die Proteinfraktion des Rahms als Pellet gewonnen werden konnte. Es fand seinen Einsatz auch im zweiten Teil bei der Untersuchung von Milch und Kolostrum BSE- bzw. Scrapie-infizierter Schafe mittels PrionScreen® und Western-Blot. Auch das Eutergewebe und die Milchfraktionen von drei BSE-Kühen wurden untersucht. Im Eutergewebe vom Rind war PrPC-Expression mittels EIA und IHC mit individuellen Unterschieden nachweisbar, nicht jedoch mittels Western-Blot. Bei den kleinen Wiederkäuern hingegen ließ sich PrPC mit allen drei verwendeten Methoden darstellen. In der IHC zeigte sich, dass die Expression das gesamte Zytoplasma der Laktozyten umfasste und PrPC-haltige Vesikel ins Alveolarlumen abgeschnürt wurden. Beim Rind dagegen beschränkte sich die PrPC Expression auf basolaterale Abschnitte der Laktozyten. In Kuhmilch konnte - im Gegensatz zu kürzlich erschienenen Publikationen - kein PrPC detektiert werden. Die kleinen Wiederkäuer zeigten jedoch eine individuelle und - wie anhand des Laktationszyklus eines Schafes nachvollziehbar - laktationsphasen-abhängige PrPC-Expression in den Milchfraktionen Magermilch, Molke und somatische Zellen. Neben den vom Hirngewebe bekannten drei Isoformen (zweifach-, einfach- und unglykosyliert) waren im Western-Blot mit mAk P4 zwei trunkierte Formen auf Höhe von ca. 8 und 14 kDa darstellbar. Dabei handelt sich vermutlich um N-terminale Fragmente. In Kasein war nur bei einigen Schafen PrPC im EIA nachweisbar. Rahm konnte aufgrund seiner Aufarbeitung mittels Detergentien nur im Western-Blot untersucht werden. Es zeigten sich bei Schaf und Ziege dieselben PrPC- Banden wie in den bereits beschriebenen Milchfraktionen. Bei den Proben TSE-infizierter Schafe zeigte sich sowohl bei Rahm aus Milch als auch bei Rahm und Molke aus fettreichem Kolostrum, die eine ähnliche Aufarbeitung erfuhren, PK-resistente Banden. Diese Banden zeigten sich auf Höhe der drei Volllängen-Isoformen sowie der 8-kDa-Form. Eine Abklärung erfolgte im PrionScreen®-EIA durch Einsatz der aus Rahm gewonnenen Proteinpellets. Darin reagierten sieben von 13 Milchproben der Scrapie-Tiere und acht von 108 der BSE-Schafe positiv. Dabei handelte es sich durchweg um Kolostrumproben (etwa 26 % der untersuchten Kolostrumproben). Auch im anschließenden Western-Blot mit einem Aliquot aus der Digestionsplatte des PrionScreen® zeigten sich bei einem Teil der positiven EIA-Reagenten Banden auf PrPC-Höhe. Durch die Kontrolle mit einem unspezifischen Primärantikörper konnte nicht eindeutig gezeigt werden, ob die Banden PrP-spezifisch sind. Ein ähnliches Phänomen bei somatischen Zellen aus Schaf-Kolostrum ist von EVEREST et al. (2006) bekannt. Man muss daher davon ausgehen, dass es sich um eine unspezifische Reaktion des Kolostrums handelt. Rahm aus Milch reagierte im PrionScreen® eindeutig negativ, ebenso Molke aus Milch im Western-Blot. Die Eutergewebeproben der drei BSE-Kühe reagierten negativ in EIA, Western-Blot und IHC. Auch in ihrer Magermilch war kein PrPres detektierbar. Die Kaseinfraktion reagierte positiv im PrionScreen®, wobei eine unspezifische Reaktion jedoch nicht ausgeschlossen werden konnte. Obwohl die Untersuchungen an klinisch gesunden Tieren gezeigt haben, dass PrPC als Replikationsmatrix für die Bildung von PrPSc im Euter und der Milch vorhanden ist, brachten die Analysen der TSE-infizierten Tiere letztlich keinen Beweis für das Vorkommen von PrPres in Milch. Lediglich im Kolostrum von TSE-infizierten Schafen zeigten sich untypische PK-resistente Formen. Eine Gefährdung des Verbrauchers durch Milch und Milchprodukte ist daher mit größter Wahrscheinlichkeit nicht gegeben.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Die Rolle von Parkin bei der Parkinson-Erkrankung: Physiologische Funktion und Mechanismen der Inaktivierung

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later May 30, 2007


Mutationen im Parkin-Gen sind verantwortlich für eine autosomal rezessiv vererbbare Form der Parkinson-Erkrankung. Der Funktionsverlust von Parkin spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit war lediglich bekannt, dass Parkin eine E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität besitzt und dass ein Funktionsverlust von Parkin offensichtlich zur Parkinson-Erkrankung führen kann. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei fundamentale Themenbereiche der Parkin-Forschung bearbeitet: 1. Die Analyse der Mechanismen der Inaktivierung von pathogenen Parkin-Mutanten. 2. Untersuchungen zur physiologischen Funktion von Parkin. Im ersten Teil dieser Arbeit konnten verschiedene Mechanismen der Parkin-Inaktivierung aufgeklärt werden, welche den Funktionsverlust von Parkin erklären. Pathogene C-terminale Deletionsmutationen führten zur Missfaltung und Aggregation von Parkin. Im Gegensatz zu Wildtyp-Parkin nahmen diese Mutanten spontan eine missgefaltete Konformation an und lagen in Form von zytosolischen Aggregaten vor. Pathogene Punktmutationen in der N-terminalen Ubiquitin-like (UBL)-Domäne verringerten die Stabilität von Parkin. Diese Mutanten wurden rasch über das Proteasom abgebaut. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte ferner gezeigt werden, dass in vivo zusätzlich zu Volllängen-Parkin eine kleinere Parkin-Spezies entsteht. Diese kleinere Parkin-Spezies ist gekennzeichnet durch das Fehlen der N-terminalen UBL-Domäne und wird aufgrund des Vorhandenseins eines internen Startcodons an Position 80 der humanen Parkin-Sequenz gebildet. Der zweite Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die physiologische Funktion von Parkin. In Zellkultur-Modellen konnte festgestellt werden, dass Parkin nach Stressbehandlung hochreguliert wird und vor Stress-induziertem Zelltod schützt. Die Analyse von protektiven Signaltransduktionswegen konnte erstmalig zeigen, dass die Parkin-mediierte Aktivierung der NF-kappaB-Signaltransduktion essentiell ist für das neuroprotektive Potential von Parkin. Die vorliegende Arbeit lieferte Evidenz dafür, dass die E3-Ubiquitin-Ligase Parkin die NF-kappaB-Signalkaskade durch eine vermehrte regulierende Ubiquitylierung der zwei Signalmoleküle, IKK und TRAF2 aktiviert. Die in dieser Doktorarbeit dargestellten Ergebnisse ermöglichen Einblicke in die physiologische Funktion von Parkin sowie die Mechanismen, die zum Funktionsverlust von Parkin führen. Darüber hinaus können diese neuen Erkenntnisse einen Beitrag leisten zum besseren Verständnis pathogener Mechanismen der Parkinson-Erkrankung.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Vergleichende Untersuchung der regulierten Genexpression von integrierter und episomaler HIV-1 LTR

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later May 9, 2007


Erkenntnisse zur funktionalen Zellkernarchitektur wurden bisher überwiegend an fixierten Zellen durch in situ Methoden erlangt. Durch Etablierung eines Lebendzell-Systems sollte überprüft werden, ob es möglich ist, ein einzelnes Transgen auf DNA-Ebene zu visualisieren und es bei seiner transkriptionellen Aktivierung zu beobachten. Das hier entwickelte „Gene Positioning System“ (GePS) nutzt das Lac-Operator/Lac-Repressor-GFP-System („Gene Tag“) als visualisierende Komponente, um das Indikatorgen auf DNA-Ebene sichtbar zu machen. Das Indikatorgen selbst basiert auf der induzierbaren Transkriptionseinheit von HIV-1, die spezifisch durch das virale Protein Tat aktiviert werden kann und die Transkription eines Reportergens (DsRed) kontrolliert. Im transient transfizierten Status konnte das Indikatorgen als Episom durch Bindung des „Gene Tags“ als punktförmiges Signal im Kern detektiert werden. In den etablierten und charakterisierten Zelllinien HeLa-Indi war dies durch Bindung des „Gene Tags“ an 64 Lac-Repressor-Bindungsstellen eines einzelnen Transgens nicht möglich. Die Etablierung der stabilen Zelllinien und die transiente Expression ermöglichten einen direkten Vergleich der Transkription von der integrierten und episomalen HIV-1 LTR. In beiden Fällen konnte eine spezifische Transkriptionsaktivierung durch Tat auf Protein- und RNA-Ebene beobachtet werden. Auch eine Tat-unabhängige Basisaktivität in Form von Volllänge-Transkripten konnte immer nachgewiesen werden, die in verschiedenen Zelllinien und dem episomalen Indikatorgen aber zu keiner nachweisbaren Proteinexpression führte. Die induzierte Expression des Indikatorgens des „GePS“ konnte darüber hinaus in wichtigen HIV-1 Zielzellen (CD4 positive Lymphozyten) gezeigt werden. Des Weiteren konnten Erkenntnisse über die Tat-induzierte, von der HIV-1 LTR ausgehenden Transkription und der Zusammenhang zum Spleißen gewonnen werden. Durch quantitative PCR wurde deutlich, dass sowohl im epsiomalen als auch integrierten Status erst durch die gesteigerte Transkription das Spleißen der Indikatorgen-RNA induziert wird, das Spleißen also co-transkriptionell stattfindet. Tat selbst spielt bei der Rekrutierung von Spleißfaktoren nur eine indirekte Rolle, da durch die transkriptionsdefiziente Mutante Tat(K41A) kein Spleißen initiiert wird. Durch verschiedene methodische Ansätze wurde versucht, die Frage der Chromatinzusammensetzung von nicht replizierenden Episomen in menschlichen Zellen zu beantworten. Weder durch eine Colokalisations-Untersuchung noch eine Chromatin IP konnte jedoch eine spezifische Assoziation des episomalen Indikatorgens mit dem Histon H3 nachgewiesen werden. Eine Bindung von Proteinen an die Episomen konnte am Beispiel von p50, einer Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκB, gezeigt werden. Für die produktive Replikation der Retroviren ist die Integration der proviralen DNA ins Genom der Wirtszelle nötig, jedoch konnte für HIV gezeigt werden, dass nicht integrierte zirkuläre HIV-DNA in sich nicht teilenden Zellen persistiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vermutung, dass nicht integrierte retrovirale DNA transkribiert werden kann und dadurch die exprimierten Proteine Bedeutung für den Lebenszyklus von HIV und durch ihre Persistenz Einfluss auf die Wirtszellen haben können.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Aggregationsverhalten des Polyglutaminproteins Ataxin-3 in vitro und in Zellkultur

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later May 16, 2006


Neurodegenerative Polyglutamin (polyQ)-Erkrankungen sind durch neuronalen Zellverlust und die Bildung von intrazellulären Proteinablagerungen (Aggregaten) charakterisiert, deren Rolle nicht exakt geklärt ist. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß sie die Pathogenese reflektieren und untrennbar mit dem Erkrankungsprozeß verbunden sind. In dieser Arbeit wurde das polyQ-Protein Ataxin-3 (AT3) untersucht, welches, wenn es einen verlängerten polyQ-Bereich besitzt, die Spinozerebellare Ataxie 3 (SCA3) hervorruft. Mit Hilfe von AT3-Deletionsmutanten wurde gezeigt, daß die Entfernung des N-Terminus von polyQ-verlängertem AT3 zu dessen Aggregation in vitro, in Hefe und in Neuroblastomazellen führt. Entsprechend löst die proteolytische Spaltung von pathologischem Volllängen-AT3 die SDS-resistente Aggregation in vivo aus. Hinweise auf die Calcium-abhängigen Calpaine als AT3-schneidende Proteasen wurden in vitro mit Säugetierzell-Lysaten erhalten. Gereinigtes Calpain II generiert mehrere AT3-Fragmente in vitro, einschließlich C-terminaler Fragmente, die den polyQ-Bereich enthalten. In Zellkultur resultiert die Aktivierung von Calpainen in einer verstärkten AT3-Proteolyse, während eine Inhibition von endogenem Calpain durch Calpeptin oder Calpastatin zu einer verringerten AT3-Spaltung und reduzierter Aggregation in Säugerzellen führt. Zusammenfassend unterstützen diese Daten die "toxic fragment"-Hypothese, die als Voraussetzung für Pathogenese und Aggregation von polyQ-Proteinen deren proteolytische Spaltung postuliert. Toxizität der polyQ-Proteine soll unter anderem aus der Rekrutierung von anderen zellulären Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, Chaperonen, Ubiquitin und Proteasomen in die polyQ-Aggregate resultieren. Obwohl Wildtyp-AT3 nicht selbständig aggregiert, koaggregiert es mit polyQ-verlängertem AT3-Fragment, was mit einer verringerten AT3-Konzentation in der Zelle korreliert. Einer Konformationsänderung des Wildtyp-AT3, induziert von pathologischem polyQ, folgt in vitro eine Rekrutierung in frühe Aggregationsintermediate und letztendlich die Integration in stabile Koaggregate. Weitere Experimente zeigten, daß die Expression der molekularen Chaperone (Hitzeschockproteine) Hsp70 und Hsp40 zusammen mit polyQ-verlängertem AT3-Fragment die Aggregation vermindert und den proteasomalen AT3-Abbau in vivo verstärkt. Das Chaperon p97 (VCP) zeigt eine konzentrationsabhängige Modulation der Aggregation in vitro. Schließlich konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß eine Veränderung der zellulären Lokalisation durch Fusion von AT3-Konstrukten mit Kernlokalisations- und Kernexportsignalen keinen Einfluß auf die Aggregationsfähigkeit in Neuroblastomazellen hat. Das putative endogene Kernlokalisationssignal von AT3 mit der Sequenz RKRR (282-285) wurde nicht verifiziert.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Biochemische Charakterisierung von Histon-Methyltransferasen aus Drosophila melanogaster

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Nov 22, 2004


In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden Histon-Methyltransferasen Su(var)3-9 und E(Z) aus Drosophila melanogaster charakterisiert. Die Histonmethylierung als Modifikation war schon länger bekannt gewesen, bis zum Jahr 2000 war jedoch vor allem die Acetylierung etwas genauer untersucht worden. Su(var)3-9 war die einzige bekannte Histon-Lysin-Methyltransferase, als diese Arbeit begonnen wurde. Zur Charakterisierung wurde das myc-getagte Enzym aus Drosophila-Kernextrakt durch Affinitätschromatographie aufgereinigt und zunächst die Substratspezifität festgestellt. Wie das humane Enzym Suv39H1 methyliert es ebenfalls spezifisch H3-K9 (Lysin 9 im Histon H3). Das aus den Kernextrakten aufgereinigte Enzym besitzt aber auch die Fähigkeit, ein an H3-K9 präacetyliertes Substrat zu methylieren. Die Vermutung, dass Su(var)3-9 mit einer Histondeacetylase assoziiert ist, konnte durch Verwendung von TSA als HDAC-Inhibitor bestätigt werden. Es stellte sich heraus, dass HDAC1 (Rpd3) mit Su(var)3-9 assoziiert ist. Um das Enzym besser untersuchen zu können, wurde es als Volllängenprotein und als Deletionsmutante in E. coli exprimiert. Die Aufreinigung des rekombinanten Enzyms sowie seine Lagerbedingungen wurden optimiert. Das Volllängenprotein Su(var)3-9 liegt – wie durch Gelfiltration festgestellt - als Dimer vor, die Interaktion mit sich selbst ist über den N-Terminus vermittelt. Su(var)3-9 bindet an sein eigenes, bereits methyliertes Substrat. Dies wurde an Peptiden untersucht, die den ersten 20 Aminosäuren des Histons H3 entsprechen, und entweder an Lysin 9 dimethyliert oder unmodifiziert waren. Die Interaktion mit dem methylierten Substrat ist auf die Chromodomäne von Su(var)3-9 zurückzuführen, ist jedoch schwächer als die Wechselwirkung von HP1 mit methyliertem H3-K9. Des weiteren wurde eine Drosophila-Zelllinie stabil mit Su(var)3-9 transfiziert. Das überexprimierte Protein ist jedoch nur schwach aktiv. Die Tatsachen, dass Su(var)3-9 mit HDAC1 interagiert sowie mit seinem eigenen Substrat assoziiert, ermöglichen die Aufstellung von Hypothesen über die bis jetzt kaum erhellte Ausbreitung von Heterochromatin in euchromatische Bereiche. Durch die Wechselwirkung mit der Deacetylase könnte Su(var)3-9 auch in aktiv transkribierte Bereiche vordringen und diese methylieren. Die Acetylierung, Zeichen für aktive Transkription, würde durch die Methylierung ersetzt werden. Die Interaktion mit seinem umgesetzten Substrat könnte verhindern, dass das Enzym sich nach der Reaktion entfernt, vielmehr könnte Su(var)3-9 entlang eines DNA-Stranges sukzessive alle Nukleosomen methylieren. Die darauffolgende Bindung von HP1 an methyliertes H3-K9 könnte den heterochromatischen Charakter des Chromatins verstärken und für längere Zeit festlegen. Aus Drosophila-Kernextrakten gelang es weiterhin, den E(Z)/ESC-Komplex über Säulenchromatographie aufzureinigen. Dieser enthält neben E(Z), ESC, p55 und Rpd3 auch Su(z)12. E(Z), ESC und Su(z)12 gehören der Polycomb-Gruppe an. Deren Funktion ist die dauerhafte Repression der homöotischen Gene. Sie spielen daher eine wichtige Rolle im „Zellgedächtnis“ während der frühen Entwicklung von Drosophila. Es konnte gezeigt werden, dass der E(Z)/ESC-Komplex Lysin 9 sowie Lysin 27 im Histon H3 methyliert. Außerdem wurde in vitro ein Teilkomplex aus rekombinantem E(Z), p55 und ESC rekonstituiert, der das Histon H3 methylieren kann. Ein Teilkomplex, der E(Z) mit mutierter SET-Domäne enthält, ist nicht in der Lage, H3 zu methylieren. Die Vorhersage, dass E(Z) aufgrund seiner SET-Domäne eine Methyltransferase sein müsse, konnte durch vorliegende Untersuchungen bestätigt werden. Polycomb ist ein weiteres Protein aus der Polycomb-Gruppe. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses Protein spezifisch an das Histon H3 bindet, das an K27 trimethyliert ist. Polycomb besitzt wie HP1 eine Chromodomäne. Aus den vorliegenden Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Nach der Methylierung von H3-K9 sowie H3-K27 durch den E(Z)/ESC-Komplex in homöotischen Genen, die schon abgeschaltet sind und weiterhin reprimiert werden müssen, bindet Polycomb an dieses Methylierungsmuster. Polycomb befindet sich in einem großen Komplex mit weiteren Polycomb-Gruppen-Proteinen. Die Bindung dieses Komplexes an Chromatin könnte ein denkbarer Mechanismus sein, wie die dauerhafte Repression der homöotischen Gene vermittelt wird. Um den E(Z)/ESC-Komplex genauer untersuchen zu können, wurden Viren für das Baculosystem hergestellt, so dass eine Einzel- oder auch Coexpression der Proteine möglich ist. Die Aktivität von E(Z), das im Baculosystem exprimiert wurde, ist nicht besonders hoch. Es bindet unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen weder an DNA, noch an Histone noch an H3-Peptide, die methyliert sind. Innerhalb des E(Z)/ESC-Komplexes bindet E(Z) an p55, Rpd3, ESC sowie Su(z)12. Su(z)12 interagiert mit p55, Rpd3 und E(Z). Die weiteren Interaktionen werden am besten durch eine bildliche Darstellung (siehe Abb. 86) vermittelt. In einem Luciferase-Assay wurde eine repressive Wirkung von E(Z) festgestellt. Dieses Experiment bedarf allerdings eines aktivierten Systems. Ferner muss durch Mutationsanalysen sichergestellt werden, dass die repressive Wirkung auf die Methyltransferase-Aktivität von E(Z) zurückzuführen ist. Kürzlich wurde entdeckt, dass E(Z) sowie Su(z)12 in verschiedenen Tumoren überexprimiert sind. Noch ist weder deren Funktion in den Tumorzellen klar, noch weiss man, ob die Überexpression der Grund oder eine Folge der Tumorbildung ist, noch kennt man alle Zielgene, die durch eine Überexpression von E(Z) und Su(z)12 beeinflusst werden. In nächster Zeit sind hier Einsichten in die Wirkungsweise von E(Z), Su(z)12 und anderen Polycomb-Gruppen-Proteinen zu erwarten.