Podcasts about das gen

Fordernd, ständig online, aber umweltbewusst – das sind Attribute, die typischerweise der Generation Z zugeschrieben werden. Sie ist als Thema in den Medien allgegenwärtig, vor allem über die Arbeitsauffassung der nächsten Generation von Beschäftigten wird aktuell viel diskutiert. Dabei stellt sich die Frage, was aus wissenschaftlicher Sicht dahintersteckt und ob sich daraus wirklich Maßnahmen für Unternehmen ableiten lassen, die junge Talente dieser Generation einstellen wollen.

Kollaboration statt Ellenbogen im Agenturleben, das ist eines der vielen Dingen, die Nico Combes, Co-Founder und Managing Director, mit seinem Unternehmen ODALINE erreichen möchte. In dieser Folge erzählt er, welche Alleinstellungsmerkmale das Unternehmen hat, was hinter dem ersten TikTok One-Stop Shop steckt und welche spannenden Effekte Nico im Gen Z Marketing bereits erlebt hat. Wenn ihr noch mehr über die Veränderungen im Medienkonsum erfahren möchtet, dann seid auf Nicos Einblicke gespannt. Außerdem berichtet Euch Hostin Kira Marie Cremer in der Rubrik „New Work News“ noch etwas ganz Besonderes. Viel Spaß!

Die meisten Verbrechen kommen aus heiterem Himmel, brechen über die Betroffenen herein wie ein Unwetter. Doch in diesem Fall ist es anders. Eine tickende Zeitbombe inmitten von schaulustigen Beobachtern und Mitwissenden, die doch nur wie angewurzelt dastehen und mit ansehen, wie Minute für Minute und Sekunde um Sekunde die Chance auf Rettung verstreicht. Rückblickend werden sie sagen: Ja, es hat Anzeichen gegeben. Viele Anzeichen. Nur leider niemanden, der diese Ernst nahm. Am Abend des 29. Februars 2000 schreibt Katherine Knight mit ihrer blutrünstigen Tat in ihrem Heimatland Geschichte. Ganz Australien hält den Atem an. Niemand hätte sich erträumen lassen, dass ein Mensch - und dann auch noch eine Frau - zu so etwas fähig ist. Doch was war es, das Katherine Knight zu einer kaltblütigen und skrupellosen Mörderin machte? Das Gen des Bösen? Eine tragische Kindheit? Oder einfach purer Hass, der sich gegen Männer richtete? All diesen Fragen und noch vielen weiteren widmen wir uns in dieser Folge. TRIGGERWARNUNG: Diese Folge enthält detaillierte Gewaltbeschreibungen und thematisiert häusliche Gewalt, sexualisierte Gewalt an Kindern und Gewalt, die sich gegen Tiere richtet. Mit den folgenden Zeitangaben könnte ihr die entsprechenden Stellen überspringen: (Erwähnung = keine detaillierten Beschreibungen) 05:36 - 5:45 Erwähnung häuslicher und sexualisierter Gewalt 06:15 - 6:35 Erwähnung sexualisierter Gewalt 07:17 - 7:30 Erwähnung häuslicher und sexualisierter Gewalt 09:55 - 10:05 Erwähnung Gewalt an Tieren 10:19 - 10:28 Erwähnung Gewalt an Tieren 10:40 - 10:55 Detaillierte Gewaltbeschreibung & Gewalt an Tieren 17:23 - 17:33 Erwähnung Gewalt an Kindern 18:48 - 19:00 Erwähnung Gewalt an Kindern 26:31 - 26:53 Gewalt an Kindern 33:58 - 34:20 Detaillierte Gewaltbeschreibung & Gewalt an Tieren 35:09 - 35:15 Erwähnung Gewalt an Tieren 48:15 - 48:40 Detaillierte Gewaltbeschreibung 49:10 - 49:55 Detaillierte Gewaltbeschreibung 51:42 - 54:23 Schilderung Tathergang 53:20 - 53:53 Detaillierte Beschreibung extremer Gewalt Hilfsangebote: Telefonseelsorge: https://www.telefonseelsorge.de oder unter der Rufnummer 0800-111-0-111 (rund um die Uhr) Der "Weisse Ring" hilft Menschen, die Opfer von Kriminalität und Gewalt, egal in welcher Form, geworden sind: https://weisser-ring.de oder unter der Rufnummer 116-006 (tägl. von 7 bis 22 Uhr) Hilfetelefon Gewalt an Männern: https://www.maennerhilfetelefon.de oder unter der Rufnummer 0800-123-99-00 (Mo. - Do. 8 bis 20 Uhr, Fr. 8 bis 15 Uhr) Alle Hilfsorganisationen sind über die angegeben Internetseiten auch online über einen Chat zu erreichen. // Kontakt: // Denise Instagram: podcast.stimmenimkopf E-Mail: podcast.stimmenimkopf@gmail.com Pia Instagram: pia.liest_ Pia Web: www.pia-liest.de // Quellen: // https://www.youtube.com/watch?v=yZECP-GriOI https://www.youtube.com/watch?v=OD8ZR4sPPMA https://www.bka.de/DE/AktuelleInformationen/StatistikenLagebilder/Lagebilder/Partnerschaftsgewalt/partnerschaftsgewalt_node.html https://www.re-empowerment.de/gewalt/ausstieg/hindernisse-warum-ich-blieb/ https://www.dieterwunderlich.de/Katherine_Mary_Knight.htm https://en.wikipedia.org/wiki/Katherine_Knight https://www.youtube.com/watch?v=QPXexxSrT1w https://murderpedia.org/female.K/k/knight-katherine.htm // Musik: // https://www.youtube.com/user/myuuji https://www.youtube.com/user/kmmusic

Den Bruder richtig und heil sehen wollen, das genügt. Ein Kurs in Wundern interpretiert und vermittelt von Reinhard Lier Mehrmals wöchentlicher Podcast in der Telegramgruppe https://t.me/ekiw_reinhards_kommentare Weitere Infos und Termine unter https://www.reinhard-lier.com oder im Youtubekanal https://www.youtube.com/user/ReinhardLier

Den Bruder richtig und heil sehen wollen, das genügt. Ein Kurs in Wundern interpretiert und vermittelt von Reinhard Lier Mehrmals wöchentlicher Podcast in der Telegramgruppe https://t.me/ekiw_reinhards_kommentare Weitere Infos und Termine unter https://www.reinhard-lier.com oder im Youtubekanal https://www.youtube.com/user/ReinhardLier

Der Podcast ist aus der Telegramgruppe in der regelmässig Themen aus "Ein Kurs in Wundern" besprochen werden. Link zum Telegramkanal unter https://t.me/ekiw_reinhards_kommentare Weitere Infos und Termine unter http://geistesschulung.eu/ Die Podcast können auch auf Soundcloud gehört werden https://soundcloud.com/der_kurs/sets/reinhard-lier Spenden gerne unter geistesschulung.eu/spende/

Die biologische Uhr ist ein Grundelement aller Tiere und vieler Pflanzen. Und sie tickt unabhängig von äußeren Einflüssen. Auch ohne den Wechsel zwischen hell und dunkel, ohne Temperaturschwankungen läuft das Uhrwerk regelmäßig weiter. Vor 50 Jahren wurde das erste Gen entdeckt, das an der Steuerung der inneren Uhr beteiligt ist. Das Gen wurde in einem Tier entdeckt, das die meisten Menschen lästig finden. Biologen sehen es dagegen mit anderen Augen. Es ist eines der wichtigsten biologischen Forschungsobjekte der letzten 120 Jahre: Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Weitere Infos auf www.BiOfunk.net

Anlässlich der Vergabe des Chemie Nobelpreises begeben sich Sina und Leon in die Tiefen der Gen-Editierung und erklären was das Thema der Stunde, CRISPR/Cas9, ist, was es kann, und warum es die Wissenschaft den Verstand verlieren lässt. Außerdem: Spannende Fakten über Tomaten ... rein klicken lohnt sich also. Wie immer, viel Spaß! Feedback gerne an: podcastgesundheit@gmail.com - wir freuen uns!

(Sa) Arte 20:15: Das Gen, Wissenschafts-Doku (Sa) NDR 23:20: Klassik in Corona-Zeiten. Die NDR-Radiophilharmonie feiert 70. Geburtstag, (So), ARD 20:15: Tatort: Du allein

Thu, 19 Dec 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16556/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16556/1/Hartlmueller_Ilona.pdf Hartlmüller, Ilona ddc:610, ddc:600, Medizin

Die Schizophrenie ist eine psychiatrische Erkrankung,die phänotypisch in vielgestaltigen Querschnittsbildern auftreten kann.Die Äthiopathogenese der Schizophrenie ist bis heute nicht geklärt.Es wird aber davon ausgegangen, dass sie einem polygenen Erbgang folgt und multifaktorielle Bedingungen zum Ausbruch der Krankheit führen.Ein alternativer Ansatz versucht nun mithilfe von klar definierten Endophänotypen Gene zu identifizieren, die mit neuroanatomischen, neurophysiologischen oder biochemischen Korrelaten einer Erkrankung assoziiert sind.In Zusammenhang mit der Schizophrenie gehören Lern- und Gedächtnisfunktionen zu den häufig untersuchten Endophänotypen. Das Gen für den Brain-Derived-Neurotrophic-Factor (BDNF) auf Chromosom 11 ist ein Neurotrophin, das im adulten ZNS protektiv und regenerativ auf Neuronen und Motoneuronen wirkt. BDNF wird stark im Hippocampus exprimiert, einer Hirnregion, die in Lern- und Gedächtnisfunktionen involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass BDNF in die hippocampalen Funktionen der Langzeitpotenzierung eingreift. Unter Berücksichtigung der Omnipräsenz des BDNF im humanen Gehirn liegt auch die Vermutung nahe, dass veränderte Genexpression oder Funktionalität dieses Neurotrophins neuronale Krankheiten begünstigen oder bedingen können. In diesem Zusammenhang wird auch eine Assoziation von BDNF mit Schizophrenie diskutiert. Ein im humanen BDNF-Gen häufig vorkommender Polymorphismus ist der SNP rs6265 an Position 196 der mRNA. Er bewirkt einen Aminosäureaustausch von Valin nach Methionin und wurde bereits intensiv in Zusammenhang mit Schizophrenie untersucht. Die vorliegende Studie untersuchte an 135 schizophrenen Patienten kaukasischer Abstammung und 313 gesunden Kontrollprobanden deutscher Abstammung, ob ein Zusammenhang zwischen dem rs6265 und Schizophrenie oder Gedächtnisleistungen nachzuweisen ist. Mit einer adaptierten deutschen Fassung der Welcher Memory Scale Revised (WMS-R) wurde bei allen Studienteilnehmern Gedächtnisleistungen erfasst. Anschließend erfolgten die Analysen der Allel- und Genotypfrequenzen sowie die Zuordnung zu den Ergebnissen aus den Gedächtnistests. Im Ergebnis konnte in der Fall-Kontroll-Assoziationsstudie keine signifikante Assoziation zwischen dem rs6265 und Schizophrenie festgestellt werden. Darüber hinaus konnte in der Endophänotypenstudie keine Assoziation zwischen rs6265 und Gedächtnisleistungen nachgewiesen werden. Ein Trend zeigte sich aber im Untertest „Verbales Gedächtnis“ des WMS-R. Dabei erzielten Met-Homozygote im Durchschnitt bessere Leistungen als Träger des Val-Allels. Ob der rs6265 die Gedächtnisleistungen oder die Suszeptibiltät für Schizophrenie beeinflusst, konnte mit dieser Arbeit nicht abschließend geklärt werden. Folgestudien mit strikten Ein- und Ausschlusskriterien und größeren Stichproben sind nötig, um diese Frage abschließend zu klären.

Thu, 29 Apr 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11429/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11429/1/Miller_Christina.pdf Miller, Christina ddc:610, ddc:600, Medizinische Fakultät

Die Charakterisierung und Kultivierung von Tumorzelllinien mit Hilfe einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur gilt als Standardmethode in der Zellbiologie. Dreidimensionale (3D) Modelle gewinnen jedoch immer mehr an Bedeutung, da sie die Tumorbiologie in Bezug auf physiologisch relevante Zusammenhänge bei der Tumorentstehung und –progression besser abbilden als eine herkömmliche 2D-Kultur. Die auf poly-HEMA beschichteten Zellkulturplatten induzierten multizellulären Tumorspheroide reflektieren die Morphologie von avaskularen Tumoren und Mikrometastasen. In der vorliegenden Arbeit werden anhand von HER2-überexprimierenden Tumorzelllinien die Unterschiede der HER2-Signalaktivierung und –weiterleitung in 2D- und 3D-Kultur umfassend beschrieben. In 3D-Kultur konnte ohne Zugabe von zusätzlichen Wachstumsfaktoren eine stärkere HER2-Phosphorylierung beobachtet werden. Bei der Brusttumorlinie SKBR-3 bildet HER2 in 2D-Kultur bevorzugt Heterodimere mit HER3, wohingegen in Spheroiden HER2-Homodimere vorliegen. Diese Homodimere lokalisieren in lipidreichen Mikrodomänen und begünstigen die Aktivierung des Ras-MAPK-Wegs, der die Proliferation der Tumorzellen reguliert. Mit Hilfe des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab, der spezifisch für HER2 ist, kann die Proliferation der Zellen und die Phosphorylierung von HER2 im 3D-System besser inhibiert werden. Zusätzlich konnte in 3D eine Herunterregulierung des HER2/HER3 assoziierten PI3K-Akt-Signalwegs nachgewiesen werden. Bei SKBR-3 war in 3D-Kultur neben der stärkeren Phosphorylierung von MAPK auch die Aktivierung der Integrin 4/Rac1/PAK2-Signalkaskade zu beobachten. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit in 3D-Kultur die Zelllinie SKBR-3 HR generiert, die resistent gegen die Behandlung mit Trastuzumab ist. Die Charakterisierung dieser Linie zeigte eine verstärkte Expression von DARPP-32 und eine gesteigerte HER2/HER3-Heterodimerbildung, gefolgt von einer Hochregulierung des PI3K-Akt-Wegs. Das Gen für DARPP-32 liegt im ERBB2-Amplikon und liegt bei vielen Brusttumorproben und –zelllinien amplifiziert vor. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierte Resistenz reversibel ist und die erneut Trastuzumab responsiven Zellen eine schwächere Expression von DARPP-32 aufwiesen, gefolgt von einer reduzierten Aktphosphorylierung. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass das beschriebene 3D-Modell einige in vivo Aspekte des HER2-Signalmusters besser reflektiert und deshalb als Basis für die weitere Aufklärung des Wirkmechanismus von Trastuzumab dienen kann. Außerdem kann dieses 3D-System zur Identifizierung von neuen Zielmolekülen herangezogen werden um Therapiestrategien zu entwickeln, welche eine Behandlung der HER2-positiven Patientenpopulation erlaubt, die bisher nur suboptimal auf die Behandlung mit Trastuzumab angesprochen haben.

Die Alzheimer-Krankheit (AD), die häufigste Form der Demenz, manifestiert sich klinisch meist ab dem 65. Lebensjahr mit langsam progredienten Gedächtnis-, Orientierungs- und Aufmerksamkeitsstörungen. Neuropathologische Korrelate sind die Amyloid-Plaques, die hauptsächlich aus extrazellulären Aggregaten des β-Amyloid-Proteins (Aβ) zusammengesetzt sind, und intrazelluläre neurofibrilläre Bündel, die aus Aggregaten des mikrotubulus-assoziierten Proteins Tau bestehen. Der „Auslöser“ der Alzheimer-Krankheit ist das β-Amyloid-Protein (Amyloid-Kaskaden-Hypothese), welches durch proteolytische Prozessierung von βAPP (β-Amyloid-Vorläufer-Protein) entsteht. Dies geschieht, indem zuerst BACE-1 (β-site APP cleaving enzyme 1) und anschließend der γ-Sekretase-Komplex βAPP schneiden. Menschen mit Down-Syndrom (DS), welches die häufigste autosomale Chromosomenaberration darstellt, entwickeln bereits ab einem Alter von 40 Jahren die typischen neuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit und zeigen mit einem Durchschnittsalter von 56 Jahren die klinischen Symptome der Demenz. Die Gründe für das frühe Auftreten der Amyloid-Plaques sind noch nicht vollständig geklärt. Das Gen für βAPP befindet sich auf dem Chromosom 21, welches im DS dreifach vorhanden ist, und wird daher mit der frühen Plaque-Pathologie im Down-Syndrom in Zusammenhang gebracht. BACE-1 konnte durch Überexpressions- und Knock-out-Experimente eindeutig als alleinige β-Sekretase identifiziert werden. In Gehirnen von Alzheimer-Demenz-Patienten konnten im Vergleich zu Kontrollgehirnen erhöhte BACE-1-Proteinmengen und BACE-1-Aktivitäten nachgewiesen werden. Es war deshalb interessant zu untersuchen, ob auch im Gehirn von Down-Syndrom-Patienten die BACE-1-Proteinexpression erhöht ist. Durch eine Hochregulation von BACE-1 im Down-Syndrom könnte vermehrt βAPP prozessiert und somit Aβ gebildet werden. Daher war es das Ziel der vorliegenden Arbeit die Expression von BACE-1 in Gehirnen (Temporal- und Frontallappen) von DS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgehirnen zu analysieren. In der Western-Blot-Analyse der Gewebeproben konnte gezeigt werden, dass die BACE-1-Proteinmengen im Down-Syndrom im Vergleich zu den Kontrollen (K) 1,4-fach erhöht waren. Die Proteinexpressionen von βAPP zeigten sich im DS im Vergleich zu den Kontrollen 1,4-fach erhöht. Diese Ergebnisse erzielten keine Signifikanz, zeigten aber deutliche Trends im Expressionsverhalten. Dies könnte auf die Anzahl der untersuchten Gehirne (Temporal- und Frontallappen je 3 DS, 4 AD und 5 K), Qualitätsmängel der Gehirnproben oder einer ungleichen Verteilung der Proteinexpression im Gewebe zurückzuführen sein. Es ist daher notwendig mehr Gehirne zu untersuchen. Zudem wäre es interessant in Gehirnschnitten das Verteilungsmuster der BACE-1-Expression im DS genauer zu studieren. Die Ergebnisse deuten jedoch auf eine Hochregulation von BACE-1 im DS-Gehirn und somit auf eine Beteiligung der Protease an der Plaquepathologie des Down-Syndroms hin. BACE-1 scheint also sowohl in der Pathogenese der Alzheimer-Demenz als auch in der des Down-Syndroms eine zentrale Rolle einzunehmen. Daher ist es sehr interessant die Regulation von BACE-1 weiter zu analysieren. Da in p25-überexprimierenden Mäusen erhöhte BACE-1-Proteinexpressionen gezeigt werden konnten, vermutete man eine Beteiligung von p25 an der Regulation der β-Sekretase. p25, das im Gehirn der AD-Patienten vermehrt gebildet wird und aus der Proteolyse von p35 entsteht, bindet und aktiviert die Kinase cdk5. cdk5 phosphoryliert unter anderem das Tau-Protein und wird daher mit der Bildung der neurofibrillären Bündel in Zusammenhang gebracht. Durch die Hochregulation von BACE-1 könnte p25 in der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung eine neue Bedeutung zugeschrieben werden. Zur Analyse der p25 induzierten Veränderungen in den Neuronen wurden humane Neuroblastomazellen mit einem induzierbaren p25-Expressionsvektor, Sp25-Zellen, verwendet. In diesen p25-überexprimierenden Zellen konnten sowohl in der Western-Blot-Analyse als auch in der BACE-1-Aktivitätsmessung erhöhte BACE-1-Proteinexpressionen bzw. BACE-1-Aktivitäten gezeigt werden. Die Northern-Blot-Analyse der Sp25-Zellen ergab erhöhte BACE-1-mRNA-Spiegel, die sich jedoch in einer für endogene BACE-1-mRNA untypische Größe detektieren ließen. p35, das membrangebundene Vorläufer-Protein von p25, war indes nicht in der Lage die BACE-1-Proteinexpression in humanen Neuroblastomazellen zu erhöhen. Die Ergebnisse der Sp25-Zellen konnten in p25-überexprimierenden murinen Neuroblastomazellen, Np25-Zellen, nicht reproduziert werden. Daher ist es notwendig, den p25-induzierten BACE-1-Regulationsmechanismus auf seine Reproduzierbarkeit, z.B. in weiteren In-vivo-Modellen, zu überprüfen.

Der größte Teil der chloroplastidäre Protein werden an zytosolischen Ribosomen synthetisiert und posttranslational in den Chloroplasten importiert. Einige dieser Proteine können in ihrem N-terminalen Transitpeptid von einer bislang unbekannten Proteinkinase phosphoryliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten drei bislang nur bioinformatisch beschriebene Proteinkinasen identifiziert werden, welche spezifisch chloroplastidäre Vorstufenproteine in ihrem Transitpeptid phosphorylieren. Die Proteinkinase At2g17700 wurde aus Arabidopsis-thaliana-Rosettenblätter chromatographisch angereichert und massenspektroskopisch identifiziert. Die Proteinkinasen At4g35780 und At4g38470 wurden durch einen Abgleich mit dem Proteom von Arabidopsis thaliana identifiziert. Die Übereinstimmung auf Proteinebene zu At2g17700 beträgt zwischen 58-77%. Die cDNA der Enzyme wurde kloniert und die entsprechenden Proteine heterolog exprimiert. Alle drei rekombinanten Proteinkinasen phosphorylieren eine Reihe von chloroplastidären Vorstufenproteinen. Die Substratspezifität der drei Proteinkinasen zeigt deutliche Unterschiede bei den jeweiligen Vorstufenproteinen. Mitochondrielle Vorstufenproteine werden von den drei Proteinkinasen nicht phosphoryliert. Die Phosphorylierung von pSSU und pHcf136 durch die drei Proteinkinasen findet spezifisch in der N-terminalen Transitsequenz der Proteine statt. Die Proteinkinasen At2g17700 und At4g35780 weisen vergleichbare Transkriptmengen in allen Pflanzengeweben auf. Das Gen der Proteinkinase At4g38470 hat gegenüber den anderen beiden Enzymen ein durchschnittlich höheres mRNA Expressionsniveau und scheint vornehmlich in den Wurzel und den Wurzelanlagen exprimiert zu werden. Die Analyse von T-DNA-Insertionslinien für die Proteinkinasen At2g17700 und At4g35780 hat erste Hinweise erbracht, dass diese Enzyme auch für die Vorstufenprotein-Phosphorylierung in vivo verantwortlich sind. Die Phosphorylierung von pSSU durch Blattextrakt, gewonnen aus den jeweiligen Mutanten, ist um bis 60% reduziert. Aus Wildtyp-Pflanzen gewonnenes Blattextrakt lässt sich mit Antiserum gegen rekombinantes At2g17700 um 50% in seiner pSSU-Phosphorylierung depletieren. Bei den drei Proteinkinasen handelt es sich um eine Proteinfamilie, die vermutlich für die Vorstufenprotein-Phosphorylierung von Chloroplastenproteinen verantwortlich ist. Differenzen in der Substratspezifität und in den mRNA-Expressionslevel weisen auf unterschiedliche Aufgaben der drei Kinasen in der Zelle hin.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem proteolytischen System des Chloroplasten höherer Pflanzen und hier speziell mit dem des Thylakoidsystems. Vorderstes Ziel war die Isolierung und Charakterisierung neuer, bislang unbekannter Komponenten. Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Ansätze erprobt: Einmal der rein biochemische Weg, bei dem der Versuch unternommen wurde, speziell lichtinduzierte proteolytische Aktivitäten des Thylakoidlumens nachzuweisen, anzureichern, und, falls möglich, aufzureinigen. Mit dem zweiten Ansatz wurde zunächst versucht, in Sequenzvergleichen auf molekularbiologischer Ebene homologe Gene zu bekannten bakteriellen und cyanobakteriellen Proteasen im pflanzlichen Genom ausfindig zu machen, und ausgehend von diesen dann die zugehörigen Genprodukte zu isolieren und charakterisieren. 1. Nachweis, Charakterisierung und Aufreinigung lichtstreßinduzierter Proteasen des Thylakoidlumens: Die zu diesem Ansatz durchgeführten Experimente konnten im Thylakoidlumen von Erbsenchloroplasten durch den Einsatz von Aktivitätstests auf substrathaltigen Polyacrylamidgelen mindestens fünf distinkte proteolytische Aktivitäten sichtbar machen. Diese Aktivitäten erwiesen sich als eindeutig induzierbar durch Hochlicht. Sie wurden jedoch sämtlich durch in äußerst geringer Menge vorliegende Komponenten des Lumens hervorgerufen. An der dadurch, sowie zusätzlich durch einen Lichtadaptationseffekt des Pflanzenmaterials, bedingten schlechten Reproduzierbarkeit der Aktivitäten scheiterten schließlich sowohl die Charakterisierung der unbekannten Proteasen als auch deren weitere Aufreinigung. Die Arbeiten sind dennoch dazu angetan, eine Vorstellung von der Größe und Komplexität des proteolytischen Systems alleine des Thylakoidlumens zu vermitteln. 2. Klonierung der Gene neuer plastidärer Proteasen und Charakterisierung der zugehörigen Genprodukte: Im Rahmen der Arbeit wurden die Gene zweier zuvor nicht beschriebener mutmaßlicher Proteasen aus Arabidopsis thaliana L. isoliert, beides Homologe zu bekannten Proteasen aus E. coli. hhoA: Das Produkt dieses Gens stellt ein Mitglied der ubiquitär verbreiteten HtrA-Familie von Serinproteasen dar, deren Zahl sich in Arabidopsis auf mittlerweile vierzehn beläuft. Es besitzt die typische katalytische Triade der Familie, läßt jedoch die zumindest für die meisten charakterisierten Homologe typische sogenannte PDZ-Domäne im N-terminalen Bereich vermissen. In den Experimenten zur Kartierung des Gens konnte gezeigt werden, daß dieses in singulärer Kopienzahl auf Chromosom IV lokalisiert ist. Anschließende Untersuchungen zur Expression konnten in Pflanzen jedoch weder unter normalen Anzuchtsbedingungen, noch nach Streßexperimenten mit Hochlicht und Hitzestreß ein spezifisches Transkript nachweisen. In vitro-Experimente belegten die Transkribier- und Translatierbarkeit des Gens; dessen Produkt im in organello-Importexperiment als lösliche Komponente im Thylakoidlumen akkumulierte. Weitere Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen aus Spinat und Arabidopsis unter Zuhilfenahme eines gegen das heterolog exprimierte gereifte Genprodukt produzierten polyklonalen Antikörpers bewiesen, daß hhoA auch in vivo synthetisiert wird und wie im Importexperiment im Thylakoidlumen lokalisiert ist. Verschiedene Versuche zur Funktion des Proteins brachten kein eindeutiges Ergebnis. Die Transformation von Arabidopsis mit Sinnund Gegensinnkonstrukten des Gens war zwar erfolgreich, erzeugte jedoch Pflanzen ohne erkennbar vom Wildtyp abweichenden Phänotyp. sppA: Das Homolog zu der Signalpeptid-prozessierenden Protease aus E. coli, Protease IV, stellt das bislang einzige beschriebene in höheren Pflanzen dar. Das Gen ist, wie in Experimenten zu seiner Kartierung gezeigt wurde, in singulärer Kopienzahl im Genom vorhanden, lokalisiert auf Chromosom I. In Untersuchungen zur Expression konnte das Transkript unter normalen Anzuchtsbedingungen nicht nachgewiesen werden. Bei Behandeln der Pflanzen mit Lichtstreß über längere Zeit wurde jedoch ein nach mehrstündiger Latenzzeit einsetzendes Ansteigen der Transkriptrate beobachtet. Das Genprodukt wurde nach in vitro-Transkription und -Translation im in organello-Importexperiment als peripher mit der stromalen Oberfläche der Thylakoidmembran assoziiert charakterisiert. Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen mittels Antikörpern, die gegen den C-Terminus des heterolog exprimierten SppA-Proteins produziert worden waren, bestätigten neben dem Nachweis des Vorhandenseins auch unter Normalbedingungen diese Lokalisation auch in vivo. Bei weiterer Subfraktionierung der Thylakoide fand sich das Protein vornehmlich assoziiert mit Stromathylakoiden. Die bei Bestrahlung der Pflanzen mit hohen Lichtintensitäten steigende Expressionsrate deutet auf eine funktionelle Neudefinierung von SppA in photosynthesetreibenden Organismen im Vergleich zu E. coli und auf eine Rolle innerhalb der langfristigen Adaptationsmechanismen der Pflanze gegen Lichtstreß hin. Weitere Untersuchungen konnten jedoch keine eindeutigen Hinweise bezüglich der spezifischen Funktion des Proteins liefern.

In dieser Arbeit wurden vier Gene aus T. versicolor isoliert und charakterisiert, die an der Kupferversorgung des Trans-Golgi-Netzwerks, in dem Laccase mit Kupfer beladen wird,beteiligt sind. Die zwei Kupferpermease-Gene cupA und cupB (copper uptake permease) konnten durch Komplementation der S. cerevisiae Deletionsmutanten ∆ctr1 bzw. ∆cup5 mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert werden. Die aus den beiden Genen abgeleiteten Proteinsequenzen zeigen strukturelle Homologien zu den Proteinen aus der Ctr-Familie und weisen ein in dieser Familie konserviertes MxxxM-Motiv auf. Die Expression beider Gene wird in T. versicolor durch Kupfermangel induziert und durch Kupfergabe reprimiert. Das Gen für das cytosolische Kupferchaperon TahA (Trametes ATX1 homolog) wurde mittels PCR mit degenerierten Primern isoliert. TahA zeigt deutliche Homologie zu Atx1 aus S. cerevisiae, HAH1 aus dem Menschen und CCH aus A. thaliana. TahA kann in Hefe Atx1 funktionell ersetzen: sowohl als Kupfertransportprotein zur im Golgi lokalisierten Kupfer-ATPase Ccc2, als auch bei der Entgiftung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Der Promotor des tahA-Gens enthält Motive, die im Promotor der durch Kupfer regulierten Gene Metallothionein (CUP1) und Cu/Zn-Superoxiddismutase (SOD1) aus S. cerevisiae konserviert sind. Das tahA-Gen wird unter erhöhten Kupferkonzentrationen (>0,25 µM) exprimiert und unter Kupfermangel reprimiert. Es unterscheidet sich somit in der Regulation deutlich vom ATX1-Gen, das unter Eisenmangel und oxidativem Stress induziert wird. Das Gen für die im Golgi-Netzwerk lokalisierte Kupfer-P-Typ-ATPase, ctaA (copper transport ATPase), wurde durch die funktionelle Komplementation einer Hefe ∆ccc2-Mutante mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert. Dadurch wurde zugleich die physiologische Funktion des Proteins bei der Kupferversorgung des Golgi-Netzwerks gezeigt. CtaA weist deutliche Homologien zu den bekannten Kupfer-P-Typ-ATPasen aus dem Menschen (MNKP und WNDP), aus A. thaliana (RAN1) und S. cerevisiae (Ccc2) auf. CtaA enthält alle wichtigen Motive, die für die Kupfertransport- und ATPase-Funktionen in allen anderen Kupfer-P-Typ-ATPasen konserviert sind. Durch die deregulierte Koexpression von tahA und ctaA in S. cerevisiae sowie in T. versicolor konnte eine im Vergleich zum Wildtypstamm bis zu achtfach höhere Laccase-Expression erreicht werden. Dies zeigt, dass die Überexpression von Genen, die an der Versorgung des sekretorischen Systems mit Kupfer beteiligt sind, ein Mittel darstellt, um die Expression von sekretierten, kupferabhängigen Enzymen zu steigern. Durch Anzucht von T. versicolor unter Kupfermangel wurde eine Apo-Form der Laccase hergestellt und gereinigt, die kein für blaue Oxidasen typisches Absorptionsmaximum bei 600 nm besaß und die kaum Aktivität aufwies. AAS-Untersuchungen zeigten, dass weniger als ein Kupferion pro Laccase-Molekül in dieser Proteinpräparation vorhanden war. Durch die in vitro Beladung dieser Apo-Laccase mit Kupfer konnte die Enzymaktivität wiederhergestellt werden. Die Bedingungen hierfür waren ein niedriger pH-Wert,reduzierende Bedingungen und das Vorhandensein von NaCl. Eine spontane Beladung der Laccase im Golgi scheint daher ohne Mitwirkung eines weiteren Faktors möglich zu sein.

Das Gen des Selenoproteins PHGPx war in der Arbeitsgruppe im Verlaufe einer Expressionsklonierung als antiapoptotisches Gen für Burkitt-Lymphom-Zellen kloniert worden. Die Komplexität der kotranslationalen Inkorporation von Selenocystein, welches bei Selenoenzymen Teil des reaktiven Zentrums ist, limitiert die Überexpression und erschwert die funktionelle Analyse der Selenoproteine sowohl in vitro als auch in vivo. Die PHGPx und das ebenfalls Selenocystein-abhängige mitochondriale Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System sind bei der Detoxifikation von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt, die in der mitochondrialen Atmungskette erzeugt werden. Im Gegensatz zur PHGPx vermittelt die Thioredoxin- Reduktase ihre Schutzfunktion vor oxidativem Stress über Thioredoxin-abhängige Peroxidasen, die sogenannten Peroxiredoxine. Aufgrund einer möglichen Redundanz beider Systeme sollten beide Gene in Mäusen gezielt zerstört und bei Bedarf doppel-knock-out-Tiere erzeugt werden. Da das Fehlen der funktionellen, mitochondrialen Thioredoxin-Reduktase möglicherweise nicht mit dem Leben vereinbar ist, wurden Mäuse unter Verwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems etabliert, bei welchen das Gen zunächst aktiv ist. Die Inaktivierung der Thioredoxin-Reduktase 3 erfolgte durch Einkreuzen von transgenen Mäusen, die die Cre-Rekombinase in allen Geweben exprimieren. Die aus dieser Verpaarung abstammenden, heterozygoten knock-out-Mäuse zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp. Erste Ergebnisse zeigen, dass homozygote TR3 knock-out-Mäuse wahrscheinlich embryonal oder perinatal letal sind. Bei der Inaktivierung des PHGPx-Gens in Mäusen wurden zwei Strategien verfolgt. Die lacZ knock-in-Strategie sollte ermöglichen, die Gewebeexpression der PHGPx zu studieren. Die konditionale knock-out-Strategie wurde parallel verfolgt, weil zu Beginn der Arbeit nicht abzusehen war, ob homozygote PHGPx knock-out-Mäuse lebensfähig sind oder ob Probleme mit der männlichen Fertilität zu erwarten sind. Schon lange war bekannt, dass die PHGPx im Hoden hoch exprimiert ist. Wie sich dann im Laufe dieser Arbeit herausstellte, handelte es sich bei dem konditionalen PHGPx knock-out ebenfalls um einen direkten knock-out. Durch die beabsichtigte konditionale knock-out-Strategie wurde ein Spermienkern-spezifisches, alternatives Exon des PHGPx-Gens zerstört. Diese neue Form der PHGPx wurde kloniert, das Hoden-spezifische Expressionsmuster und die Kernlokalisation des alternativenExons durch GFP-Fusionsproteine gezeigt. Geleitet von den in dieser Arbeit und von Ursini et al. (1999) beschriebenen neuen Funktionen der PHGPx in der Spermatogenese und den vergeblichen Versuchen, das veränderte PHGPx-Allel in Mäusen in die Keimbahn zu bekommen, wurden die Hoden und Spermien von den PHGPx- Chimären analysiert. Die Analyse der Chimären zeigte einen Phänotyp der partiellen Hodenatrophie und schweren Missbildungen der Spermien, der dem von Selendefizienten Nagetieren sehr ähnlich ist. Die bei diesen Chimären beobachtete Haploinsuffizienz führte zu der Entscheidung, die konditionale knock-out-Strategie für PHGPx zu ändern. Letztendlich gelang es, mit der neuen konditionalen knock-out- Strategie Keimbahntransmission zu erhalten. Dadurch wurde nicht nur das gesteckte Ziel, ein Maus knock-out-Modell für die PHGPx zu etablieren, erreicht, sondern es wurden viele zusätzlich wichtige neue Erkenntnisse über die Struktur und Funktion der PHGPx in der Spermienreifung gewonnen. Die Cre-vermittelte Inaktivierung des konditionalen PHGPx-Allels wird in Kürze erwartet.