Podcasts about zielzelle

In dieser Episode von Science to Go des Personal Training Zug Podcasts, erkläre ich euch in kürze, was Fettverbrennung ist, wie der Prozess der Fettverbrennung von statten geht und was dabei beachtet werden soll. Dabei werden wird den Prozess der Fettverbrennung in drei Segmente unterteilen: 1. Lipolyse 2. Mobilisation 3. Beta Oxidation. Zuerst werden Triglyceride in ihre Bestandteile Glycerin und Fettsäuren heruntergebrochen. Die Fettsäuren sind dann der Bestandteil, der dann eigentlich in Energie umgewandelt werden kann. Sobald die Fettsäuren vom Glycerin durch Lipase abgespalten wurden, werden die Fettsäuren über die Mobilisation durch den Blutkreislauf durch Serum Albumin bis an die Zielzelle z.B. Muskelzelle herantransportiert. Danach wir die Fettsäure in die Zelle eingeschleust und kann dann in den Mitochondrien oxidiert werden wobei ATP entsteht. Genau dieses ATP (Adenosin-Tri-Phosphat) kann dann als Energie verwendet werden. Was ist Fettverbrennung? Wie läuft die Fettverbrennung ab? Was beeinflusst die Fettverbrennung? Was ist ein Kaloriendefizit? @personaltrainingzug www.personaltrainingzug.com Janosch Bourgeois

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen die C-Komponente des Non-haemolytic Enterotoxin (Nhe)-Komplexes von Bacillus cereus sowie deren Einsatz zur Analyse der Rolle des NheC im Hinblick auf die Wirkungsweise von Nhe. NheC wurde in Escherichia coli rekombinant exprimiert und mittels Immunaffinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Überprüfung durch SDS-PAGE und Quantifizierung mittels SYPRO® Ruby Protein Gel Färbung wurde das gereinigte Toxin als Immunogen eingesetzt. Nachfolgend konnten drei mAk vom IgG-Subtyp (mAk 2G8, 1E12, 2F10) und ein mAk vom IgM-Subtyp (mAk 3D6) gegen NheC hergestellt werden. Die Charakterisierung der mAk erfolgte mittels Enzymimmuntest (EIA), Western Immunblot und Immunfluoreszenzmikroskopie. Bei Verwendung eines indirekten EIAs erlaubten die mAk den sensitiven Nachweis von rNheC im unteren Nanogrammbereich (Nachweisgrenze 10 – 15 ng/ml). Untersuchungen zur Spezifität der mAk innerhalb des Nhe-Komplexes mittels indirekten EIAs und Western Immunblots zeigten, dass die mAk 2G8 und 1E12 substantielle Kreuzreaktionen mit der strukturverwandten NheB-Komponente aufweisen. Dies konnte durch Epitopanalysen und kompetitive Bindungstests noch bestätigt werden. Während die mAk 2G8, 1E12 und 3D6 mit allen überprüften B. cereus-Stämmen reagierten, weist das von dem mAk 2F10 erkannte Epitop eine stammspezifische Variabilität auf. In Zellkulturtests war keiner der vier mAk in der Lage die zytotoxische Aktivität des Nhe-Komplexes zu neutralisieren. Demgegenüber gelang es mit allen mAk mittels Immunfluoreszenz erstmals die direkte Bindung von NheC an die Zielzelle darzustellen. Unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums gegen NheC als Fangantikörper und der vier mAk gegen NheC als Nachweisantikörper wurden hochempfindliche Sandwich-EIAs für den Nachweis von gereinigtem NheC entwickelt. In natürlichen B. cereus-Überständen konnten jedoch nur geringe Mengen (< 10 %) des theroretisch vorhandenen NheC nachgewiesen werden. Die auf diesen Ergebnissen basierende Hypothese, dass NheC in Lösung an NheB gebunden vorliegt, konnte zunächst in artifiziellen Systemen bestätigt werden. Mangels SDS-Stabilität der NheB-NheC-Komplexe, erfolgte der Nachweis mittels intermolekularem Cross-Linking und Dot Blot-Analysen. Durch Kombination des NheC-spezifischen mAk 3D6 als Fangantikörper und des HRP-gekoppelten mAk 1E11 gegen NheB als Nachweisantikörper konnte ein spezifischer NheC/B-Sandwich-EIA zum Nachweis von NheB-NheC-Komplexen in B. cereus-Kulturüberständen etabliert werden. Zur Analyse der Funktion der NheB-NheC-Komplexe wurde zum einen die Komplexbildung mit der Zytotoxizität verglichen, und zum anderen per Durchflusszytometrie deren Zellbindung mittels NheB-Quantifizierung (durch mAk 1E11) bestimmt. Fazit ist, dass scheinbar sowohl eine definierte Menge an NheB-NheC-Komplexen, als auch ausreichend freies NheB vorhanden sein müssen, damit effiziente Zellbindung und Zytotoxizität von Nhe gewährleistet sind.

Die Bakteriophagen Integrase PhiC31 stellt ein viel versprechendes Werkzeug zur Integration genetischen Materials im nicht viral-basierten Gentransfer dar. Die PhiC31 Integrase vermittelt die Rekombination von spezifische Erkennungssequenz attB enthaltenden Plasmiden mit natürlich vorkommenden attP Erkennungssequenzen innerhalb des Zielgenoms mit unterschiedlicher Integrationsfrequenz und -spezifität. Nebeneffekte der Integration in Form von insertioneller Mutagenese, wie z.B. große Deletionen und chromosomale Veränderungen im Genom der Zielzelle konnten beobachtet werden. Ziel dieser Dissertation war, die PhiC31 vermittelte Effizienz zu verbessern und die Spezifität zu adressieren. Als Ansatz wurde die Mutagenese der DNA-Bindungsdomäne der Integrase basierend auf Punktmutanten zur verbesserten Integrationseffizienz gewählt. Integrationsassays wurden in verschiedenen humanen Zelllinien durchgeführt. Etablierung von Doppelmutanten, sowie Dosisoptimierung des Integrase kodierenden Plasmids verbesserten die Integrationseffizienz mehr als dreifach, verglichen mit der Wildtypintegrase in den Zelllinien HeLa und HCT. Weitere Assays verglichen die Exzisionsaktivität der Integrasemutanten mit dem Wildtyp. Bei fünf Mutanten wurde eine etwa zweifach erhöhte Exzision gefunden. Die Beurteilung der Spezifität der Integrasemutanten erfolgte durch Substitution der Wildtyp-attP Sequenz mit drei Pseudo attP Erkennungssequenzen des Reporterplasmids, deren erhöhte Spezifität bereits dokumentiert war. Einzelne Mutanten zeigten eine zweifach erhöhte Exzisionsaktivität. Die Rekombinationsaktivität von Integrasemutanten wurde im Kontext chromosomaler DNA mittels einer stabil GFP-exprimierenden Reporterzelllinie, in der die eGFP Expression mittels Integrase-vermittelter „Raus-Rekombination“ eines polyA Stoppsignals angeschaltet wird, untersucht. Auf chromosomaler Ebene wurde keine verbesserte Ausschneidungsaktivität erreicht. Zur Evaluierung der in vivo Effizienz zweier ausgewählter PhiC31 Integrasemutanten, die in vitro erhöhte Integrationsaktivität aufwiesen, wurden zwei Plasmide am C57BL/6 Mausmodell getestet. Reportergen war ein für den humanen Koagulationsfaktor IX kodierendes Gen. In Abhängigkeit von der Integrationseffizienz der Mutanten und des Wildtyps, wurden im Zeitraum von einhundert Tagen ähnliche Expressionslevel gefunden. Die Mutanten zeigten keine Verbesserung der Langzeitexpression von humanem Faktor IX. Die hier durchgeführten Studien zur Mutationsanalyse der Phagenintegrase PhiC31 zeigten einen wirksamen Ansatz zur Verbesserung der PhiC31 Integrase-vermittelten Integrationseffizienz in vitro.

Willkommen in der Welt der Biologie! Mein Name ist Alia Korth und heute geht es um Adrenalin. Das Wort Adrenalin kommt aus dem Lateinischen und bedeutet in etwa “zu der Niere”. Dieser etwas seltsame Name kommt daher, dass das Adrenalin im Nebennierenmark gebildet wird. Das Hormon Adrenalin wird in Stresssituationen ins Blut abgegeben und löst so eine ganze Reihe von Abläufen im Körper aus. Die Wichtigsten sind eine Steigerung der Herzfrequenz, ein Anstieg des Blutdrucks, eine Erweiterung der Bronchiolen, welche eine erhöhte Aufnahme von Sauerstoff ermöglicht, eine schnellere Bereitstellung von Energiereserven durch Fettabbau, eine Umwandlung von Glukose, also Traubenzucker, in verschiedene Stoffe, sowie im “Normalzustand” des Körpers eine Regulierung des Blutdrucks und der Magendarmtätigkeit. Aber wie funktioniert das eigentlich, was ist ein Hormon? Das Wort Hormon kommt aus dem Griechischen und bedeutet “Antreiben”. Hormone sind chemische Signal- und Botenstoffe, die meist in Hormondrüsen gebildet werden. Von dort aus gelangen sie ins Blut und zu den Zielzellen. Das Hormon funktioniert wie ein Schlüssel, die Zielzelle wie ein Schloss. Nur wenn diese zusammenpassen erfolgt die vorgesehene Reaktion. Die Wirkungsdauer der Homone kann zwischen Sekunden, wie bei Adrenalin, und Tagen, wie bei dem Schilddrüsenhormon, welches den Stoffwechsel ermöglicht und bei Kindern das Wachstum fördert, reichen. Ich hoffe, dass es euch gefallen hat und würde mich freuen, wenn ihr auch beim nächsten Mal wieder einschaltet, wenn es wieder heißt “willkommen in der Welt der Biologie”. Weitere “in 2 Minuten” Podcasts findet ihr im Internet unter www.in2minuten.com.

Bei der Tumorangiogenese ist die Balance zwischen den pro- und antiangiogenen Faktoren zu Gunsten der proangiogenen Faktoren hin verschoben. Therapeutisch lässt sich die Tumorangiogenese durch eine Hemmung proangiogener Faktoren wie VEGF auch im klinischen Setting wirksam beeinflussen. In präklinischen Modellen ließ sich zeigen, dass auch durch Gabe von physiologisch vorkommenden antiangiogenen Faktoren wie Endostatin und Angiostatin das Wachstum experimenteller Tumoren signifikant gehemmt werden konnte. Angiostatin besteht aus den ersten Kringel-Domänen des Plasminogens und wird bei einer Reihe von physiologischen Prozessen im Körper durch proteolytische Spaltung freigesetzt. Es inhibiert primäres und metastatisches Tumorwachstum durch Hemmung der Tumorneoangiogenese. Da diese löslichen Faktoren eine sehr kurze Halbwertszeit aufweisen, ist eine Gabe als Protein wenig erfolgversprechend und erste klinische Daten zur Applikation von Endostatin als Protein in klinischen Studien waren enttäuschend. Ein effizienter alternativer Applikationsweg für diese Faktoren stellt zweifellos eine gentherapeutisch vermittelte systemische Überexpression dar, wie sie beispielsweise bei Gerinnungsfaktoren bereits in ersten klinischen Studien angewendet worden ist. Sowohl die Leber als auch die Muskulatur können dabei als Orte der Überexpression nach Gentransfer genutzt werden. Der Wahl und Optimierung des Vektorsystems kommt bei einer solchen Strategie ein zentraler Stellenwert zu. In der hier vorgelegten Arbeit wurde ein Vektorsystem basierend auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) für die antiangiogene Gentherapie entwickelt und optimiert. Konventionelle AAV-Vektoren basieren auf einem einzelsträngigen DNA Genom, welches von infizierten Zellen zuerst in ein doppelsträngiges Genom umgewandelt werden muss, um eine Genexpression zu ermöglichen. Dieser Schritt ist limitierend auf dem Weg zur Transgenexpression. In dieser Arbeit wurde ein sogennanter „self compementary“ AAV-Vektor (scAAV) hergestellt und charakterisiert, der in der Zielzelle primär eine doppelsträngige DNA zur Verfügung stellt. Die Strategie beruhte dabei auf Daten der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. J. Samulski, Capel Hill, USA. Es wurde auf dieser Basis ein AAV-Konstrukt zur Expression des Green-Fluorescent Protein (GFP) als Markergen und ein weiteres Konstrukt zur Expression von Angiostatin kloniert und in einem AAV-Serotyp 2 verpackt. Das scAAV-Vektorsystem zeigte in vitro eine um eine log-Stufe stärkere Genexpression (GFP) als konventionelle AAV-Vektoren. Damit wurden die Daten der amerikanischen Arbeitsgruppe bestätigt. In funktionellen in-vitro-Experimenten zeigten sich die scAAV/Angiostatin-Vektoren den konventionellen AAV/Angiostatin-Vektoren signifikant überlegen bei der Hemmung der Proliferation von Endothelzellen. In der Zusammenfassung konnte im Rahmen dieser Arbeit der Grundstein gelegt werden für die Anwendung von scAAV zur Expression von Angiostatin im Rahmen der Gentherapie von Tumoren.

Für die Therapie der HIV-Infektion stehen verschiedene Substanzklassen zur Verfügung. T-20 (Handelsname Fuzeon®) ist ein Fusionsinhibitor, der in seinem Aufbau einem Teil des Hüllproteins von HIV-1 entspricht. Die Hülle von HIV-1 wird von mehreren gp120-gp41-Komplexen durchsetzt, welche Trimere bilden und durch nicht-kovalente Bindungen assoziiert sind. Die Ektodomäne von gp41 besteht aus vier wichtigen Strukturen: einem hydrophoben, glycinreichen Fusionspeptid, einer N-terminalen stabartigen α-Helix (Heptad repeat 1), einem Verbindungsstück mit cysteinreichem Loop (zwischen HR1 und HR 2) und einer zweiten C-terminalen α-Helix (Heptad repeat 2). Die Fusion wird u. a. durch Konformationsänderungen im gp120-gp41-Komplex und innerhalb eines gp41 ermöglicht. Als Inhibitor der räumlichen Umstrukturierung von HIV-1-gp41 agiert T-20 durch spezifische extra-zelluläre Bindung an gp41. Dadurch wird die Fusion zwischen viraler Zellmembran und Zielzelle blockiert und das Eindringen der viralen RNA in die Zielzelle verhindert. Die T-20-Resistenz wurde zunächst dem GIV-Motiv im N-terminalen Teil von gp41 zugeschrieben. Auch C-terminale Mutationen betreffend wurden resistenzsteigernde Effekte beschrieben. Ziel dieser Arbeit war die Erforschung C-terminaler Mutationen als Antwort auf N-terminale Aminosäureänderungen und ihre Darstellung in einem Proteinmodell. Entgegen den Erwartungen lagen die beobachteten Mutationen in HR2 oftmals den HR1-Mutationen nicht gegenüber, sondern waren häufig sogar an der Außenseite der Helix lokalisiert. Neben Mutationen, die auf intra-gp41-Ebene eine Rolle spielen, spricht dies für das Vorhandensein von inter-gp41-Beziehungen.

Neben den klassischen kardiovaskulären Risikofaktoren wie arterielle Hypertonie oder Hypercholesterinämie kommen den psychosozialen Faktoren wie Stress oder Depression eine entscheidene Rolle als Risikofaktor für die Entwicklung der Atherosklerose zu. Obwohl das chronische Stresshormon Corticotropin-Releasing-Hormon im Rahmen der adaptiven Stressantwort als Hauptvertreter der Effektorhormone angesehen wird, sind die pathophysiologischen Mechanismen, die zu einer CRH/Stress-bedingten endothelialen Dysfunktion führen, weitgehend unbekannt. Diese Arbeit hatte zum Ziel, den Effekt von peripherem CRH auf die Monozyten/Endothel-Interaktion, beispielhaft die Adhäsion, herauszuarbeiten. Die Untersuchungen der Monozyten-Endothel-Adhäsion wurde in einem in-vitro-Modell unter Verwendung der Zelllinien HMEC-1 und THP-1 mit einer neuen, modifizierten fluorometrischen Methode untersucht, monozytäres MAC-1/CD11b, endotheliales ICAM-1/CD54 und VCAM-1/CD106 mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Der Nachweis der vermittelnden monozytären CRH-Rezeptoren R1/-R2 erfolgte mittels RT-PCR- und Immunfluoreszenztechnik. THP-1 konnte als Zielzelle für CRH mit Nachweis der CRH-Rezeptoren auf mRNA- und Proteinebene identifiziert werden. CRH induzierte eine signifikante zeit- und konzentrationsabhängige Adhäsionszunahme der THP-1 Zellen am HMEC-1 Monolayer. Der Effekt scheint Monozyten-vermittelt, da CRH, konzentrationsabhängig, zu einer monozytären MAC-1/CD11b-Freisetzung führte. Eine CRH-Stimulation nur von HMEC-1 führte hingegen zu keiner Adhäsionszunahme, erklärbar z. B. durch die hier dokumentierte fehlende Veränderung von endothelialem ICAM-1/CD54 und VCAM-1/CD106 unter Einfluß von CRH. Die Ergebnisse unterstreichen somit die Relevanz von peripherem CRH auf die Monozytenfunktion und Monozyten/Endothel-Interaktion. Sie können einen Beitrag zur Erklärung eines möglichen Zusammenhangs von chronischem Stress (mit konsekutiver Erhöhung des Stresshormons CRH) und der Initiation / Progression der endothelialen Dysfunktion leisten (Wilbert-Lampen, Straube et al., 2006).

Die Pathogenität von enteropathogenen Yersinien-Spezies wird von einem Virulenzplasmid pYV kodiert. Das pYV kodiert für den Typ-III-Sekretions-/Translokationsapparat und die Yops. Sechs Yop-Effektorproteine sind bekannt, die in die eukaryote Zelle transloziert werden: YopE, YopH, YopM,YopO/ YpkA, YopP/ YopJ und YopT. Die intrazellulären Angriffspunkte und Wirkungen der einzelnen Yops auf die Zielzelle sind Gegenstand aktueller Forschung. In dieser Arbeit wurden erstmals systematisch potentielle Zytoskelettveränderungen von Thrombozyten durch Inkubation mit Yersinia-Monosekretionsmutanten YopH, YopE, YopO, YopP, YopM und den Yersinia-Monodeletionsmutanten DeltaYopH, DeltaYopE, DeltaYopT, DeltaYopO und DeltaYopM untersucht. Im zeitlichen Verlauf adhärieren uninfizierte Thrombozyten durch eine Zunahme der Fläche durch Ausbildung von Filopodien und Lamellipodien. In den durchgeführten Experimenten ähneln die mit der YopP-Monosekretionsmutante inkubierten Thrombozyten uninfizierten Thrombozyten, d.h. YopP zeigt als Einziges der untersuchtes Yops keinen Einfluss auf das Zytoskelett. Mit der YopH, YopM, YopE bzw. YopO-Monosekretionsmutante inkubierte Thrombozyten zeigen kleinere Zellflächen und eine Dominanz von abgerundeten Zellen. Dies deutet auf eine schlechtere Adhäsion der Zellen an der extrazellulären Matrix hin. In mit WA-C(pTRANS,pCJYM-HA) infizierten HeLa-Zellen konnte YopM zunächst im Zytosol, nach 2-4h Infektion zusätzlich im Zellkern lokalisiert werden. Ausserdem zeigten mit WAC(pTRANS,pCJYM-HA) infizierte HeLa-Zellen Zytoskelettveränderungen: ein ungeordnetes Zytoskelett mit Vakuolen, vereinbar mit einer Ablösung der Zelle von der Matrix. Kaya et al. konnten im Affinitätsblot in vitro eine Interaktion von YopM mit der intrazellulären Cystein-Protease Calpain zeigen. Wegen der morphologischen Ähnlichkeit zwischen mit WA-C(pTRANS,pCJYM) inkubierten bzw. mit Calpeptin, einem Calpain-Inhibitor, inkubierten Thrombozyten wurde die von Kaya et al. dargestellte Interaktion zwischen YopM und Calpain in vivo in dieser Arbeit überprüft. Die Präzipitationsversuche aus infizierten HeLa-Zellen über Calpain sowie über YopM ergaben keinen Hinweis auf eine Interaktion von YopM und Calpain. McDonald et al. publizierten RSK 1 und PRK 2 als intrazelluläre Interaktionspartner von YopM. Funktionelle Studien über die Proteine RSK 1 und PRK 2 lassen darauf schließen, dass sie regulierende Einflüsse auf das Zytoskelett, die Translation und das Zellüberleben haben. Diese Funktionen und die beobachteten Einflüsse von YopM auf das Zytoskelett der Zielzelle sind mit einem Modell vereinbar, in dem YopM die Zytoskelettveränderungen durch Interaktion mit RSK 1 und PRK 2 hervorrufen könnte. Diese Hypothese muss durch zukünftige Forschungen geklärt werden.

Die beiden Pathogen-assoziierten molekularen Muster, CpG-Oligonukleotide, als Imitate bakterieller DNA, und LPS, sind in der Lage, das menschliche Immunsystem zu stimulieren. Vor Entdeckung der Toll-like Rezeptoren konnte nicht zwischen direkten und indirekten Effekten von CpG-Oligonukleotiden und LPS auf Zellen des menschlichen Immunsystems unterschieden werden. Durch die Entdeckung der Toll-like Rezeptoren und vor allem die Charakterisierung von TLR9 als Rezeptor für CpG und TLR4 als Rezeptor für LPS entstand die Möglichkeit, die Zielzellen von PAMPs an Hand der Expression der dazugehörigen Rezeptoren zu definieren. Dendritische Zellen sind im Immunsystem des Menschen essenziell für die Auslösung einer Immunantwort. Sie sind in der Lage, eindringende Pathogene an Hand von PAMPs schnell und sicher zu erkennen, und daraufhin eine passende Immunantwort zu initiieren. Zwei Subpopulationen von dendritischen Zellen konnten kürzlich im peripheren Blut identifiziert werden: Plasmazytoide dendritische Zellen (PDC) und myeloide dendritische Zellen (MDC). In der vorliegenden Arbeit wurden die Unterschiede zwischen PDC und MDC in ihren Reaktionen auf CpG-Oligonukleotide, LPS und CD40 Ligand charakterisiert. Funktionelle Untersuchungen zeigten, dass nur PDC und nicht MDC direkte Zielzellen von CpG-ODN im humanen Immunsystem darstellen, während LPS MDC aktiviert, jedoch nicht PDC. Damit konsistent konnte auf molekularbiologischer Ebene nachgewiesen werden, dass PDC TLR9 exprimieren, jedoch nicht TLR4, während MDC den für die Erkennung von LPS notwendigen Rezeptor TLR4 besitzen, aber TLR9 nicht exprimieren. In gemischten Populationen reagierten auch myeloide dendritische Zellen auf CpG-Oligodesoxynukleotide, was auf eine indirekte Aktivierung durch plasmazytoide dendritische Zellen hinweist. PDC reagierten nach Stimulation mit ODN 2006 mit einer Hochregulation von Reifemarkern und kostimulatorischer Moleküle, der Expression von Chemokinrezeptoren, der Produktion proinflammatorischer Chemokine und einer verminderten Apoptoserate. Nach Stimulation mit ODN 2216 sezernierten sie große Mengen IFN-α, während ODN 2006 für die Induktion von IFN-α eine Kostimulation mit CD40 Ligand benötigte. Weder ODN 2006, ODN 2216 oder CD40 Ligand alleine waren in der Lage, IL-12 in PDC zu induzieren, die synergistische Stimulation von PDC mit CpG-ODN und CD40 Ligand führen jedoch zur Produktion großer Mengen an IL-12. Unter optimaler Stimulation mit ODN 2006 und CD40 Ligand können PDC damit gleichzeitig IL-12 und IFN-α produzieren. Das Verhältnis der produzierten Zytokine ist dabei abhängig vom Differenzierungsgrad der PDC. Durch zunehmende Ausreifung der PDC mit IL-3 verschiebt sich nach der Stimulation das Produktionsverhältnis an sezernierten Zytokinen zugunsten von IL-12. Ausreifung mit ODN 2006 ermöglicht PDC, zudem naive allogene CD4 Zellen zu aktivieren, und induziert in Kokulturen IL-12-abhängig ein Th1-gerichtetes Zytokinprofil in den CD4 T-Zellen. IFN-α schien dabei eine geringe Rolle zu spielen. Durch die Charakterisierung der PDC als TLR9-tragende Zielzelle für CpG-DNA, trägt diese Arbeit entscheidend dazu bei, die PDC als Schlüsselzelle für die physiologischen Wirkungen von TLR9-Liganden zu identifizieren und zu verstehen. Dies ist von hoher Relevanz für die Entwicklung therapeutischer Anwendungen von CpG-ODN in der Tumortherapie, Asthmabehandlung, Infektionsprophylaxe und als Adjuvans bei Impfungen.

Die hohe genetische Variabilität von HIV stellt ein großes biologisches Hindernis für die Entwicklung erfolgreicher Medikamente und Impfstoffe dar. Im Laufe seiner Evolution hat HIV eine Vielzahl von Untergruppen und Subtypen entwickelt, die in unterschiedlichen geographischen Regionen und Bevölkerungsgruppen eigenständige Epidemien geschaffen haben, aus denen sich die weltweite Pandemie zusammensetzt. Die hohe Evolutionsrate von HIV wird verursacht durch seine Fähigkeit, schnell zu mutieren, zu rekombinieren und sich mit einer sehr kurzen Generationszeit zu replizieren. Während die kontinuierliche Akkumulation von Punktmutationen eher zu allmählichen Veränderungen der biologischen Eigenschaften des Virus führt, können durch Rekombinationsereignisse zwischen verschiedenen Virusisolaten plötzlich größere Genomabschnitte ausgetauscht und damit eventuell fittere Varianten generiert und selektiert werden. Eine rasche Bildung von Fluchtmutanten oder Resistenzen gegen antiretrovirale Therapie sind die Konsequenz. Voraussetzung für die Bildung derartiger Mosaikgenome ist zum einen die zeitgleiche Infektion einer Zielzelle mit mehreren Virionen und zum anderen die Koinfektion eines Individuums mit mehr als einer HIV-Variante. Koinfektionen und Rekombinationen mit verschiedenen HIV-1 Subtypen sind besonders wahrscheinlich in Regionen, in denen mehrere Virusvarianten kozirkulieren, wie in Tansania, wo man die HIV-1 Subtypen A, C und D nebeneinander findet. Zur Untersuchung der genauen Subtypenverteilung mit besonderem Fokus auf rekombinante Formen und Mehrfachinfektionen wurde in der Region Mbeya im Südwesten Tansanias eine Hochrisikokohorte von 600 Barfrauen gebildet, die alle drei Monate über einen Zeitraum von vier Jahren nachuntersucht wurden (HISIS-Studie). Die initiale HIV-1 Prävalenz in dieser Kohorte betrug 67,8%. 75 zufällig aus dieser Studie ausgewählte HIV-1 positive Frauen wurden in dreimonatigen Intervallen mit dem Multiregion-Hybridisation-Assay (MHAACD) auf ihren HIV-1 Subtyp hin getestet. Dieser sensitive und durchsatzstarke Subtypisierungstest beruht auf dem Prinzip einer real-time PCR mit subtypenspezifischen Hybridisierungssonden, die an die HIV-DNA in fünf Genomregionen binden. Neben reinen Subtypen kann der MHAACD auch rekombinante Viren und Doppelinfektionen mit hoher Vorhersagekraft nachweisen. Die Verteilung der reinen (nichtrekombinanten) Subtypen zu Beginn der Studie wurde dominiert von C mit 34%, gefolgt von A mit 9% bzw. D mit nur 5%. Damit wird der größere Einfluß der südlichen Nachbarn, in denen ebenfalls der Subtyp C überwiegt, auf die Region Mbeya im Vergleich zu den nördlich angrenzenden vor allem von Sutyp A und D dominierten Staaten deutlich. 52% aller Infektionen sind entweder verursacht durch rekombinante Viren (32%) oder Mehrfachinfektionen mit Beteiligung von Rekombinanten (20%). Dieser Prozentsatz liegt sehr viel höher als in der Allgemeinbevölkerung dieser Region und impliziert daher eine Korrelation zwischen dem Risikoverhalten der Infizierten und der Wahrscheinlichkeit einer HIV-1 Mehrfachinfektion und dem Auftreten von rekombinanten Formen. Die Mehrheit der Koinfektionen schienen nicht auf einer simultanen, sondern einer sequentiellen (Superinfektion) Transmission verschiedener Virusvarianten zu beruhen, was durch den Vergleich zweier Gruppen von Barfrauen belegt wird. Erstere befanden sich in einem mittleren Infektionsstadium der HIV-1 Infektion und wiesen eine signifikant geringere Prävalenz an Mehrfachinfektionen (9%) auf als die zweite Gruppe der Teilnehmerinnen, die sich zu Beginn der Studie schon in einem Spätstadium bzw. im AIDS-Stadium befand und mit 30% einen deutlich höheren Anteil an Mehrfachinfektionen zeigte. Aus den durch den MHAACD detektierten Mehrfachinfektionen wurde eine Studienteilnehmerin mit einer fortgeschrittenen HIV-1 Infektion zur detaillierten Analyse der viralen Populationen ausgewählt. Sie entwickelte innerhalb von 12 Monaten nach Eintritt in die Studie AIDS definierende Symptome und verstarb kurz darauf an den Folgen der Immunschwäche. Der an fünf aufeinanderfolgenden Zeitpunkten (0, 3, 6, 9, 12 Monate) durchgeführte MHAACD-Test enthüllte eine AC-Doppelinfektion in der vpu-Region. Diese konnte durch die Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von drei Genomfragmenten (gag/pol, vpu/GP120, GP41/nef) bestätigt werden. Eine detaillierte phylogenetische Sequenzanalyse der Region 2 (vpu/GP120) enthüllte eine zweite A-Variante, weshalb von einer Dreifachinfektion der Patientin ausgegangen werden kann. Zusätzlich wurden in allen drei untersuchten Genomregionen eine Reihe von aus den Elternformen gebildeten rekombinanten Viren identifiziert. Die komplexeste virale quasispecies mit mindestens acht verschiedenen molekularen Formen wurde in der Region 2 (vpu/GP120) gefunden. Die Anteile der verschiedenen viralen Varianten in den analysierten Regionen fluktierten sehr stark über den Untersuchungszeitraum von einem Jahr, weshalb eine longitudinale einer cross-sektionalen Analyse zur zuverlässigen Detektion von Koinfektionen vorzuziehen ist. Eine eindeutige Tendenz zu stärkerer Homogenisierung bzw. Diversifizierung der quasispecies mit der Manifestierung von AIDS und damit sinkendem Immundruck konnte nicht festgestellt werden. Für die Amplifikation der drei untersuchten Genomfragmente im Rahmen einer verschachtelten PCR wurden jeweils vier verschiedene Primerkombinationen verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz multipler Primerpaare eine Selektion bestimmter Virusvarianten während der PCR verringern und damit die Wahrscheinlichkeit der Detektion einer Mehrfachinfektion im Vergleich zu einer konventionellen PCR erhöhen kann. Eine weitere Sensitivitätssteigerung der Methodik wäre zukünftig durch zusätzliche Primerpaare denkbar. Die detaillierte Untersuchung der viralen Formen spielt eine bedeutende Rolle vor allem im Hinblick auf zukünftige Studien zur Evaluierung von HIV-Vakzinen, wie sie unter anderem in der Region Mbeya in Tansania stattfinden werden. Ein unvollständiges Bild der zirkulierenden HIV-Varianten kann zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse solcher Studien und in der Folge zu einer falschen Einschätzung der Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten führen.

Die Immuntherapie von niedrig malignen Tumoren stellt eine vielversprechende alternative Behandlungsmethode dar. Epstein Barr-Virus (EBV) etabliert eine latente Infektion in der Zielzelle, in der das EBV-Genom extrachromosomal aufrecht erhalten wird. EBV eignet sich mit diesen Eigenschaften hervorragend als Genvektor. Meine Aufgabenstellung war es, neue EBV-abgeleitete Genvektoren zu entwickeln, die das therapeutische Zytokin GM-CSF in Tumorzellen von B-CLL-Patienten (Chronische lymphatische Leukämie) exprimieren. Dabei entscheidend ist die Eigenschaft von EBV naive, wie auch reife und maligne B-Lymphozyten über den CD21-Rezeptor spezifisch zu infizieren. Als Grundlage diente das Maxi-EBV-System, mit dem das EBV-Genom für genetische Veränderungen zugänglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein sicherer EBV-Basis-Vektor etabliert, der replikations-defizient ist und dem zusätzlich die immortalisierenden Eigenschaften von EBV fehlen. Im selben Zuge wurden verschiedene Expressionskassetten für das Transgen GM-CSF in den EBV-Basis-Vektor eingebracht. Es konnten fünf unterschiedliche GM-CSF-Vektoren etabliert werden, die das Transgen an verschiedenen Genorten innerhalb des Maxi-EBV-Genoms tragen. Zwei dieser GM-CSF-Vektoren erzielten besonders hohe Transduktionseffizienzen und Expressionsraten in der Modellzelllinie Raji (Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie). Auch B-CLL-Zellen konnten mit guter Effizienz transduziert werden, die Expression des GM-CSF war aber deutlich schwächer. Das immunstimulatorische Zytokin GM-CSF führt in vivo zu einer verbesserten Immunantwort gegen Tumore. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass GM-CSF-haltige Überstände von Vektor-transduzierten Raji-Zellen eine Reifung von dendritischen Zellen (DC) bewirken, die als wichtige Effektoren bei einer Anti-Tumorantwort gelten. Die Funktion von GM-CSF konnte auch anhand eines Proliferationsversuchs mit einer Zytokin-abhängigen Zelllinie gezeigt werden. Darüber hinaus waren DC nach exogener Antigenbeladung in der Lage, spezifischen CD4-positiven T-Zell-Klonen effizienter ein antigenes Peptid zu präsentieren, wenn die DC in Gegenwart von GM-CSF gereift waren. Damit zeigt das nach Gentransfer sezernierte GM-CSF einen immunstimulatorischen Effekt ähnlich dem von rekombinantem GM-CSF und kann eine effizientere Antigenpräsentation von Tumorantigenen hervorrufen. Prinzipiell eignen sich B-CLL-Zellen daher als Produzenten von EBV-Genvektor-transduziertem GM-CSF, das zur immunologischen Demaskierung von B-CLL-spezifischen, tumor-assoziierten Antigenen auch in vivo führen sollte.

Diese Arbeit setzt sich mit den molekularen Mechanismen der Evolution von Virulenzfaktoren in Salmonella auseinander. Es wurde ein auf Sequenzvergleichen basierendes Verfahren eingesetzt, um neue lateral erworbene Elemente zu identifizieren, die möglicherweise Hinweise auf die Entwicklung von Virulenz und Wirtsspezifität innerhalb der Gattung Salmonella geben können. Mit Hilfe genetischer Analysen sollte darüber Aufschluss gewonnen werden, auf welche Weise diese genetischen Elemente in neue Wirtsgenome gelangen können. Des Weiteren wurde anhand der Salmonella Pathogenitätsinsel 2 (SPI2) nach möglichen Vehikeln und Transfermechanismen für den horizontalen Gentransfer gesucht. Es wurde analysiert, wie neu erworbene genetische Elemente in das regulatorische Netzwerk neuer Wirte integriert werden können und ob es Zusammenhänge zwischen der genetischen Ausstattung mit Virulenzmodulen und der Wirtsspezifität verschiedener Salmonella-Serotypen gibt. Dabei wurde festgestellt, dass einzelne Effektoren des SPI2-Virulons, die zum Teil außerhalb des SPI2-Locus im Genom kodiert sind, sehr heterogen innerhalb von Salmonella spp. verteilt sind. Diese Variabilität kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass sich diese Faktoren nicht als ein initialer Komplex in der „Ur-Salmonella“ manifestiert haben, wie es im Invasions-Virulon von SPI1 der Fall ist. Vielmehr sind die SPI2-Effektoren vermutlich in mehreren Schritten im Laufe der Evolution in das Genom von Salmonella spp. gelangt und möglicherweise auch z.T. wieder deletiert worden. Die Bedeutung der Verteilung dieser Effektorproteine für die Virulenz und die Wirtsspezifität von Salmonella wird auch dadurch offensichtlich, dass S. bongori als Besiedler kaltblütiger Wirbeltiere keines dieser zum SPI2-Virulon gehörigen Gene besitzt, die im Zusammenspiel das intrazelluläre Replizieren innerhalb warmblütiger Wirbeltiere ermöglichen. Das Kernstück des SPI2-Virulons, das für das intrazelluläre Replizieren und die systemische Ausbreitung von S. enterica im Wirtsorganismus verantwortlich ist, konnte erfolgreich transferiert werden. Der Einbau des SPI2-TTSS im SPI2-negativen System von S. bongori ermöglichte die heterologe Expression von SPI2-abhängigen Genen und die Sekretion von SPI2-Effektorproteinen in vitro. Durch die Etablierung des SifA-Phänotyps und den Nachweis der intrazellulären Lokalisation von SseF konnte gezeigt werden, dass das transferierte SPI2-TTSS zur heterologen Translokation von SPI2-Effektorproteinen aus S. bongori in die eukaryontische Zielzelle in der Lage ist.