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Die exakten molekularen und zellulären Mechanismen, welche zu Initiation und Progression der Atherosklerose und letztlich zu den gefürchteten atherosklerotischen Folgeerkrankungen, hierunter Myokardinfarkt und Apoplex, führen, sind bis heute Gegenstand vielfältiger medizinischer und biochemischer Forschungsbemühungen und noch nicht vollständig geklärt. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurde die funktionelle Rolle des Wachstumsfaktors Progranulin in der Progression der Atherosklerose in vivo in zwei Mausmodellen näher untersucht. Im Detail wurde analysiert, inwiefern Progranulin die Adhäsion und Einwanderung von Leukozyten steuert und die Ausbildung atherosklerotischer Gefäßwandveränderungen beeinflusst. Auf dem Boden eines bereits etablierten und häufig angewandten Mausmodells der frühen Atherosklerose, nämlich der ApoE-defizienten Maus, wurde ein Doppel-Knockout-Mausmodell generiert, welches überdies auch eine Defizienz des Progranulin-Gens aufweist. Auf diese Weise konnte der Einfluss von Progranulin (PGRN) auf die Atherogenese herausgearbeitet werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Defizienz von Progranulin einen erheblichen Einfluss auf die Atheroprogression nimmt. Im Doppel-Knockout-Stamm PGRN-/-ApoE-/- war, im Gegensatz zur Kontrollgruppe PGRN+/+ApoE-/-, eine erhebliche Akzeleration und Aggravation der Atherogenese zu objektivieren gewesen. Die PGRN-/-ApoE-/- - Mäuse zeichneten sich durch eine signifikant gesteigerte feste Adhäsion von Leukozyten am Gefäßendothel atherosklerotischer Prädilektionsstellen in der Makrozirkulation der Arteria carotis aus. Darüber hinaus führte die Depletion von Progranulin zu einer übersteigerten Ausbildung atherosklerotischer Gefäßwandveränderungen. Anhand eines weiteren Mausmodells, dem Cremaster-Modell, konnte der Einfluss von Progranulin auf die dynamische Leukozyten-Endothel-Interaktion in Mikrogefäßen des Musculus cremaster im Rahmen einer sterilen Inflammation untersucht werden. Hier führte die Defizienz von Progranulin zu einer ebenfalls signifikant gesteigerten festen Adhäsion von Leukozyten an das Gefäßendothel als Reaktion auf den inflammatorischen Stimulus. Ebenso konnte eine steigende Tendenz zum Rolling und zur Transmigration in das umgebende Interstitium im Vergleich zur Kontrollgruppe PGRN+/+ aufgezeigt werden. Für Progranulin konnte somit eine zentrale Bedeutung für die Initiation und Progression der Atherosklerose belegt werden: es wirkt nicht nur regulierend auf Rekrutierung und Adhäsion von Immunzellen ein, sondern entfaltet auch, nicht zuletzt durch seinen natürlichen kompetitiven Antagonismus am TNF-Rezeptor, antiinflammatorische und atheroprotektive Wirkungen. Aus der Erkenntnis der pathophysiologischen Bedeutung von Progranulin in der Atheroprogression könnte sich eine zukunftsträchtige und vielversprechende Grundlage für die Entwicklung neuer pharmakologischer Therapieoptionen zur Prävention und Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen ergeben.

Die tiefe Venenthrombose (TVT) entsteht nicht allein durch eine pathologische Blutgerinnung, sondern wird primär durch eine Entzündungsreaktion mit massiver Rekrutierung von Zellen der unspezifischen Immunabwehr ausgelöst. In der vorliegenden Dissertation wurde, mit Hilfe eines etablierten Mausmodells zur Untersuchung der zellulären und molekularen Entstehungsmechanismen der tiefen Venenthrombose (TVT), der Einfluss von Antikörpermolekülen auf die Bildung venöser Thromben untersucht - einer weiteren wichtigen Komponente in immunologischen Prozessen und bekannter Auslöser verschiedener pathologischer Geschehen. Dabei stellte sich heraus, dass Antikörpermoleküle die Entstehung venöser Thromben im Mausmodell beeinflussen: In Mäusen ohne Antikörper war die Thrombusbildung massiv beeinträchtigt und konnte durch Antikörper-Substitution wiederhergestellt werden. Es wurde eine starke Korrelation zwischen IgM-Serumspiegel und Thrombusgewicht sowie eine Beteiligung natürlicher Antikörper festgestellt. Die zugrunde liegenden Mechanismen konnten bereits in Ansätzen aufgeklärt werden: Beteiligte Antikörpermoleküle scheinen an Strukturen des hypoxischen Endothels zu binden und Einfluss zu nehmen auf die initiale Thrombozytenrekrutierung, auf die Leukozytenakkumulation im Thrombus wie auch auf die Fibrinbildung und –stabilisierung. Die gewonnenen Ergebnisse weisen demnach darauf hin, dass bestimmte Antikörpermoleküle in der Lage sind, die Entstehung einer TVT zu begünstigen. Dieses Wissen und eingehendere Forschung kann dazu beitragen, zukünftig neue prognostische Faktoren für das Auftreten venöser Thrombose zu gewinnen und Behandlungsstrategien zu entwickeln, welche die unerwünschten Nebenwirkungen einer alleinigen Hemmung der Blutgerinnung umgehen.

Das Protein α-Synuklein (α-SYN) spielt eine kritische Rolle in der Pathogenese des Morbus Parkinson. So wird angenommen, dass die Aggregation dieses Proteins für die Degeneration von dopaminergen Nervenzellen des Mittelhirns und den damit verbundenen motorischen Symptomen verantwortlich ist. Während dieser pathophysiologische Zusammenhang allgemein anerkannt ist, bleibt der Einfluss von α-SYN auf nicht-motorische Systeme des Gehirns und somit auf prämotorische Symptome, wie die häufig früh im Krankheitsverlauf auftretende Riechstörung, relativ unerforscht. Der Riechkolben bildet die erste zentrale Stelle für die Verarbeitung von Geruchseindrücken und stellt eine von wenigen Gehirnregionen mit einer außergewöhnlich hohen neuronalen Plastizität dar, da er kontinuierlich mit neuen adult-geborenen Nervenzellen versorgt wird. Selbst im erwachsenen Gehirn - wenn auch in geringerer Anzahl - wandern in diese Region neuronale Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone (SVZ) und dem rostralen migratorischen Strom (RMS) ein, die in lokale Interneurone ausdifferenzieren und in bestehende Netzwerke integrieren. Dabei bilden neue Nervenzellen funktionelle Synapsen mit bereits vorhandenen Neuronen aus und tragen zur Riechwahrnehmung bei. Aufgrund seiner Funktion an der Synapse könnte α-SYN insbesondere einen Einfluss auf die Reifung und Integration von adult-geborenen Neuronen mit möglichen pathophysiologischen Konsequenzen für den Geruchssinn haben. Um die Plastizität im Riechkolben von transgenen α-SYN Mäusen zu untersuchen, eignet sich besonders die Zwei-Photonen-Mikroskopie, da mit dieser Technik neuronale Strukturen bis hin zu einzelnen Synapsen im intakten neuronalen Netzwerk der lebenden Tiere über mehrere Tage bis Monate verfolgt werden können. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Riechkolben des verwendeten Mausmodells histopathologisch und funktionell untersucht. Die transgenen A30P α-SYN Mäuse wiesen pathologische α-SYN Ablagerungen in Mitralzellen auf, und zeigten Störungen in der feinen Geruchsdiskriminierung. Anschließend wurde eine Subpopulation von adult-geborenen Neuronen, dopaminerge periglomeruläre Neurone, die bekannterweise sensibel auf α-SYN reagieren, genetisch markiert. Mittels intravitaler Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde der neuronale Umsatz, der kontinuierliche Neugewinn und Verlust an dopaminergen Nervenzellen, in A30P α-SYN und Wildtypmäusen über einen Zeitraum von 2,5 Monaten beobachtet. Dabei wurde kein Unterschied in der Anzahl an Zellen gemessen, die ihren Zielort im Riechkolben erreichen, und möglicherweise in das Netzwerk integrieren. In den transgenen α-SYN Mäusen wiesen diese Neurone jedoch eine signifikant verkürzte Überlebensspanne auf, was insgesamt in einem Nettoverlust an Neuronen in der Glomerulärzellschicht resultierte. Interessanterweise waren von dem Zelluntergang vor allem adult-geborene Neurone, die erst kürzlich ins Netzwerk integrierten, betroffen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die frühen Schritte der neuronalen Eingliederung und Differenzierung in einen dopaminergen Phänotyp in A30P α-SYN Mäusen nicht beeinträchtigt sind, sondern vielmehr ihr längerfristiges Fortbestehen und Überleben in dem olfaktorischen Netzwerk. Möglicherweise trägt diese instabile Integration und damit gestörte Homöostase von funktionellen neuen Neuronen zu der verminderten Fähigkeit der Geruchsdiskriminierung in A30P α-SYN Mäusen bei. Um die der Riechstörung zugrunde liegenden pathophysiologischen Veränderungen weiter aufzuklären, wurde im zweiten Teil der Arbeit der Einfluss von aggregations-anfälligem A30P α-SYN auf die strukturelle und funktionelle Entwicklung von Körnerzellen, die 95% der adult-geborenen Neurone darstellen, untersucht. Während die biologischen Eigenschaften und physiologischen Mechanismen von Körnerzellen mit ihrer Rolle bei der Verarbeitung von olfaktorischen Eindrücken weitestgehend aufgeklärt sind, ist nur wenig über die synaptische Funktion und strukturelle Plastizität dieser adult-geborenen Neurone unter pathologischen Bedingungen bekannt. Deshalb wurde im Folgenden die Funktionsweise von adult-geborenen Körnerzellen an dendrodendritischen Synapsen mit stabilen Mitralzellen, die pathologisch verändertes α-SYN akkumulieren, genauer charakterisiert. Diese synaptischen Verbindungen sind von wesentlicher Bedeutung für die Geruchsdiskriminierung. Dazu wurden die gesamten dendritischen Bäume einzelner Nervenzellen mittels zeitlich kodierter lentiviraler Transduktion markiert und chronisch mikroskopiert, wobei einzelne dendritische Spines über mehrere Wochen wiederholt aufgesucht und in hoher Auflösung aufgezeichnet wurden. Adult-geborene Körnerzellen in A30P α-SYN Mäusen waren durch eine reduzierte Komplexität des Dendritenbaumes und eine erniedrigte Spineplastizität, bedingt durch einen verminderten natürlichen Zugewinn an dendritischen Spines während der kritischen Phase der Nervenzellreifung, gekennzeichnet. Dieses Spinedefizit blieb in ausgereiften und integrierten Körnerzellen bestehen. Funktionell waren die unvollständig gereiften Körnerzelldendriten durch eine signifikant verminderte elektrische Kapazität und eine gesteigerte intrinsische Erregbarkeit und Reaktionsfreudigkeit auf depolarisierende Eingangssignale gekennzeichnet, während der Spineverlust mit einer verminderten Frequenz von erregenden postsynaptischen Miniaturströmen (mEPSCs) korrelierte. Die in dieser Arbeit beschriebenen, durch A30P α-SYN vermittelten, Veränderungen der adult-geborenen Neurone wirken sich folglich störend auf die Verarbeitung von olfaktorischen Inputs aus, und könnten deshalb von pathophysiologischer Relevanz für das Verständnis von Riechstörungen in frühen Stadien des Morbus Parkinson sein. Um diesen Veränderungen therapeutisch entgegenzuwirken, wurde den transgenen Mäusen über mehrere Monate eine Substanz mit anti-aggregativen Eigenschaften verabreicht. Diese zeigte keinen therapeutischen Effekt auf das Überleben und die Spinedichte von adult-geborenen Neuronen in A30P α-SYN Mäusen. Insgesamt liefert diese Arbeit neue, fundamentale Einblicke in die A30P α-SYN-abhängige Regulation der strukturellen Plastizität als ein pathophysiologisches Korrelat für Morbus Parkinson.

Morbus Alzheimer ist die häufigste Form einer Demenzerkrankung und stellt aufgrund der steigenden Lebenserwartung eine sehr große ökonomische und emotionale Belastung für Patienten, deren Familien und die gesamte Gesellschaft dar. Eine Verringerung dieser Belastung erfordert dringend krankheitsmodifizierende Therapien, die bisher nicht zur Verfügung stehen. Als wahrscheinlichste Erklärung für die molekularen Ursachen der Krankheit wurde in der Amyloid-Kaskaden-Hypothese postuliert, dass die Akkumulation und Aggregation des Abeta-Peptids das zentrale Ereignis darstellt. Infolgedessen kommt es zu synaptischen Beeinträchtigungen durch Abeta-Oligomere, Entzündungsreaktionen durch unlösliche Abeta-Aggregate in Form von amyloiden Plaques, progressiven Schädigungen von Synapsen und Neuronen, oxidativem Stress, der Hyperphosphorylierung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau und einem Neuronenverlust. Das Abeta-Peptid wird durch sequentielle Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch die beta- und gamma-Sekretase konstitutiv im Gehirn produziert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen der Überexpression eines humanen APP mit der schwedischen Mutation auf Synapsen und die Akkumulationskinetik des Abeta-Peptids zu amyloiden Plaques in einem Alzheimer-Mausmodell (Tg2576) untersucht. Die detaillierte Charakterisierung des Mausmodells wurde in einer Therapiestudie umgesetzt, in der eine passive Immunisierung gegen das Abeta-Peptid oder Abeta-Oligomere getestet wurde. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der Überexpression des APP auf dendritische Spines untersucht, die das postsynaptische Kompartiment glutamaterger Synapsen entlang von Dendriten bilden. Als Reporter-Tiere wurden Mäuse verwendet, die das gelbfluoreszierende Protein YFP in einem Teil der pyramidalen Neuronen des Cortex exprimieren. Mithilfe der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie wurden die denritischen Spines an den apikalen Dendriten der Schicht II/III und V Neurone im somatosensorischen Cortex analysiert. Die Überexpression des APP führte zu einem differentiellen Effekt, wobei in Schicht II/III Neuronen keine Änderung und in Schicht V Neuronen eine Erhöhung der Dichte dendritischer Spines gemessen wurde. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte eine Mehrzahl an stabilen Spines als ursächlich für die erhöhte Spinedichte, während keine zeitliche Änderung der Spinedichte über sechs Wochen detektiert wurde. Auch die Morphologie der dendritischen Spines war unverändert. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche physiologische Rolle von APP und/oder dessen proteolytische Fragmente an Synapsen. Ein wichtiges neuropathologisches Merkmal von Morbus Alzheimer sind amyloide Plaques, die durch Aggregation des Abeta-Peptids zu Amyloidfibrillen mit einer gekreuzten beta-Faltblattstruktur entstehen. Demzufolge wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit mithilfe der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie, unter der wiederholten Anwendung des spezifischen fluoreszenten Markers Methoxy-X04, die Entstehungs- und Aggregationskinetik amyloider Plaques untersucht. Eine quantitative Auswertung von Plaquegrößen, -wachstumsraten und -dichten in zwei Altersgruppen der frühen und späten amyloiden Pathologie führte zur bisher detailliertesten in vivo Charakterisierung in einem Alzheimer-Mausmodell. Für eine präzise Messung der Plaquedichten wurde ein sehr großes Gehirnvolumen von 3 Kubikmillimeter pro Gruppe untersucht. In einem Langzeitversuch über 15,5 Monate mit einer zeitlichen Auflösung von einer Woche wurde erstmals eine komplette Kinetik des Plaquewachstums in einem Mausmodell beschrieben, die den gleichen Verlauf einer Sigmoid-Funktion aufwies, wie er bereits in vitro und in Alzheimer-Patienten gezeigt wurde. Die Plaquedichte stieg asymptotisch mit dem Alter an und folgte einer exponentiellen, einphasigen Assoziationsfunktion. Neu entstandene Plaques wiesen mit Abstand die kleinste Plaquegröße auf, die mit zunehmendem Alter anstieg. Die lineare Plaquewachstumsrate, gemessen als Zuwachs des Plaqueradius pro Woche, sank mit ansteigendem Alter der Mäuse, was sich in einer negativen Korrelation der Plaquewachstumsrate mit der Plaquedichte widerspiegelte. Sehr große Plaques wurden früh in der Entstehungsphase gebildet und die Größe am Ende der Untersuchung korrelierte mit ihrer Wachstumsrate. In der frühen Phase der Plaqueentwicklung nahmen die Plaques mit einer maximalen Wachstumsrate zu, die nicht durch die Abeta-Konzentration limitiert war. Die Wachstumsraten individueller Plaques waren sehr breit verteilt, was auf einen Einfluss lokaler Faktoren schließen ließ. Dieser Befund wurde gestützt durch den Langzeitversuch, da kein Zusammenhang zwischen den Wachstumsraten benachbarter Plaques detektiert wurde. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen ein physiologisches Wachstumsmodell, in dem Plaques sehr langsam über große Zeiträume wachsen bis zum Erreichen eines Äquilibriums. Durch die nachgewiesenen Parallelen zu den Befunden von in vitro Studien und in vivo Ergebnissen von Alzheimer-Patienten stellen die beschriebenen Zusammenhänge eine wertvolle Grundlage für die Translation von Ergebnissen zwischen präklinischer und klinischer Forschung zur Entwicklung von Abeta-senkenden Therapien dar. Im dritten Teil der Arbeit wurden die Effekte einer passiven Immunisierung gegen das Abeta-Peptid oder Abeta-Oligomere untersucht. Nach einer zweimonatigen Antikörper-Behandlung wurden keine Unterschiede in der Plaqueentstehungs- und Plaquewachstumskinetik gemessen. Eine in der Literatur beschriebene Akkumulation von Abeta-Oligomeren konnte durch eine in vivo Visualisierung mit einem hochspezifischen Antikörper gegen diese Molekülspezies nicht bestätigt werden. Lösliche Abeta-Peptide oder Abeta-Aggregate akkumulierten erwartungsgemäß um den amyloiden Kern von Plaques. Am Ende der Immunisierungsstudie wurde die synaptische Pathologie mittels immunhistochemischer Färbung der Prä- und Postsynapsen mit den Markern Synapsin und PSD-95 untersucht. Innerhalb amyloider Plaques wurden sehr niedrige Synapsendichten gemessen, die mit zunehmender Entfernung zum Plaque asymptotisch zu einem Plateau anstiegen. Diese Analyse zeigte erstmals, dass der Einflussbereich der toxischen Wirkung amyloider Plaques für Präsynapsen wesentlich größer ist als für Postsynapsen, was auf eine höhere Sensibilität von Präsynapsen schließen lässt. Abseits von Plaques im Cortex waren die Synapsendichten niedriger im Vergleich zu Wildtyptieren, wie durch den Vergleich der Plateaus gemessen wurde. Beide therapeutischen Antikörper zeigten eine partielle Normalisierung der Synapsendichte. Daraus folgt, dass die Abeta-Oligomere ursächlich für die Synapsenpathologie waren, da eine spezifische Neutralisierung dieser Abeta-Aggregate für einen Therapieeffekt ausreichte. Diese Ergebnisse bestätigen in vivo die toxische Wirkung von Abeta-Oligomeren auf Synapsen und beweisen eine mögliche Neutralisierung dieser löslichen Abeta-Aggregate durch eine passive Immunisierung.

Die Alzheimer-Krankheit ist die häufigste Form der Demenz mit einer stetig steigenden Zahl Betroffener. Trotz intensiver Forschung sind die genauen Ursachen noch immer weitgehend ungeklärt, mit der Folge, dass bislang keine kausale Therapie zur Verfügung steht. Als einer der vermuteten Risikofaktoren gilt das Geschlecht – Frauen erkranken häufiger und mit insgesamt schwererem Verlauf an Alzheimer als Männer. Ziel der vorliegenden Studie ist es, das transgene Mausmodell Tg2576, das ein humanes Amyloid-Vorläuferprotein mit der schwedischen Doppelmutation überexprimiert, phänotypisch umfassend zu charakterisieren und auf geschlechtsspezifische Differenzen hin zu untersuchen. Dabei werden jeweils sechs männliche und sechs weibliche Träger des Transgens (Carrier) im Alter von 6, 8, 10, 12, 14 und 16 Monaten mit ihren gesunden Wurfgeschwistern (Wildtypen) verglichen. Die Tiere werden im modifizierten Hole-Board-Test über acht Tage auf kognitive, verhaltensbedingte und motorische Parameter untersucht. Ab einem Alter von 8 bis 10 Monaten weisen die Carrier im Gegensatz zu den Wildtypen progressive, signifikante Beeinträchtigungen des deklarativen Gedächtnisses und des Arbeitsgedächtnisses auf. Damit einhergehend können eine verstärkte Anwendung nicht-räumlicher Suchstrategien sowie disinhibitorische Verhaltenstendenzen beobachtet werden. Im Geschlechtervergleich sind die kognitiven Defizite der weiblichen Carrier signifikant stärker ausgeprägt. Weiterhin zeigen sich ab einem Alter von 10 Monaten geschlechtsunabhängige, progressiv fortschreitende feinmotorische Störungen beim Fressen der Belohnungsmandeln. Die Mortalität der männlichen Carrier (48,4 %) ist signifikant höher im Vergleich zu den weiblichen Carriern (25,4 %) (p = 0,005). Die weibliche Tiere weisen ein signifikant niedrigeres Gewicht als die männliche Tiere auf (p < 0,001), wobei die Carrier signifikant weniger wiegen als die Wildtypen (p < 0,001). Laboranalysen zeigen im Geschlechtervergleich einen höheren Testosterongehalt im Blutserum der männlichen Tiere und einen höheren Östradiolgehalt bei den weiblichen Tieren. Bei der Untersuchung auf mögliche zugrundeliegende Störungen der Neurotransmission können keine mit zunehmendem Alter progressiven Veränderungen der Expression spezifischer Rezeptoren (NMDAR-NR2B, mGluR5 und PBR) im Western-Blot gezeigt werden. Insgesamt erweist sich das Tg2576-Modell als ein vielversprechendes Modell der Alzheimer-Krankheit für die weitere Grundlagenforschung und präklinische Testung therapeutischer Strategien. Dabei ist es insbesondere auch für weiterführende geschlechtsspezifische Forschungsansätze geeignet.

Tue, 14 May 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15723/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15723/1/Koch_Susanne.pdf Koch, Susanne ddc:540

Die mitochondriale Thioredoxinreduktase (Txnrd2) stellt als ubiquitär exprimiertes Selenoprotein ein wichtiges redox-aktives Enzymsystem zum Schutz vor oxidativem Stress dar. In einem Txnrd2-defizienten Mausmodell stellte sich eine embryonale Letalität am Tag E13.0 heraus. Hingegen zeigte sich in einem pankreasspezifischen Txnrd2-knockout ab der vierten Woche post partum eine spontan entstehende Pankreaserkrankung, die sich innerhalb einen Jahres zu einer fibrotischen exokrinen Pankreashypotrophie entwickelte. Dieses pankreasspezifische Modell, das durch Kreuzung einer Ptf1a-Cre transgenen Linie mit einer Mauslinie, deren Txnrd2 von loxP Sequenzen flankiert ist, generiert wurde, wird derzeit umfassend untersucht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Generierung und Testung zweier Targetingvektoren zur Etablierung eines Mausmodells, das die Überexpression der murinen Txnrd2 in unterschiedlichen Organsystemen erlaubt. Dies geschieht im Hinblick auf die Generierung eines genetischen rescue des Txnrd2-Phänotyps im bestehenden pankreasspezifischen knockout-Modell zur Klärung der Fragestellung, ob durch das Wiedereinschalten der Txnrd2 Veränderungen oder gar eine Reversibilität des beobachteten Phänotyps möglich sind.

Die vorliegende Arbeit untersuchte die Rolle der Perizyten bei steriler Inflammation. Bisher war in diesem Zusammenhang der Einfluss der Perizyten nicht bekannt, ebenso wenig ob und wie sie zu Entzündungsreaktionen beitragen. Weiterhin war der Einfluss der Perizyten auf die interstitielle Migration myeloider Zellen in vivo unerforscht. Hier konnte gezeigt werden, dass Perizyten durch eine Vielzahl von Rezeptoren wie TLR2, TLR4, TNFR1, FPR2 in der Lage sind inflammatorische Reize zu detektieren und daraufhin einen proinflammatorischen Phänotyp annehmen. Dieser ist durch die vermehrte Expression von NLRP3 sowie des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und die Sekretion von Chemokinen wie CXCL1, IL8 und CCL2 gekennzeichnet. Weiterhin wird das Chemokin-ähnliche Molekül MIF von aktivierten Perizyten sowohl sezerniert als auch an der Oberfläche präsentiert. Die ausgeschütteten Chemokine beeinflussen wiederum Monozyten und neutrophile Granulozyten durch ihre chemotaktische Wirkung. Auch konnte ein anti-apoptotischer sowie aktivierender Effekt der Perizyten auf neutrophile Granulozyten gezeigt werden, was die Überlebensdauer dieser Zellen im interstitiellen Gewebe signifikant verlängert. Anhand eines Mausmodells und der 2-Photonen Mikroskopie wurde gezeigt, dass Perizyten auch in vivo einen entscheidenden Beitrag zur Rekrutierung neutrophiler Granulozyten und Monozyten zur Inflammation leisten. Zum ersten Mal wurde die Interaktion myeloider Zellen mit Perizyten in vivo visualisiert und genauer charakterisiert. Diese Interaktion beeinflusst die interstitielle Migration neutrophiler Granulozyten und Monozyten abhängig davon, ob ein Stimulus für gerichtete oder ungerichtete Migration vorliegt. Es wurde deutlich, dass Perizyten sowohl einen chemotaktischen als auch einen haptotaktischen Reiz auf myeloide Leukozyten ausüben, was an einer Polarisierung der Zellen zu erkennen ist. Ebenso tragen sie durch die Interaktion zur Aktivierung der myeloiden Zellen in vivo bei. Diese Arbeit leistet demnach einen Beitrag zur genaueren Definition der Rolle von Perizyten bei steriler Inflammation. Hierfür wurden die zellulären und molekularen Mechanismen in vitro und die in vivo ablaufenden Prozesse bei der interstitiellen Migration myeloider Zellen genauer charakterisiert. Dabei konnten Perizyten als neuer Zelltyp identifiziert werden, der Gewebeschäden detektiert und aktiv zur akuten Entzündungsreaktion beiträgt indem er die Rekrutierung und Funktionalität myeloider Leukozyten unterstützt.

Im Rahmen des Münchener ENU-Mausmutagenese-Projekts wurde durch chemische Mutagenese die dominante mutante Mauslinie MVD013 erzeugt. Die Linie wurde an Hand einer erhöhten Zahl und eines verringerten Volumens der Erythrozyten etabliert. Außerdem zeigten einzelne ältere mutante Tiere dieser Linie zusätzliche pathologische Veränderungen wie Darmtumoren und Megakolon. Ziel der Arbeit war es, Untersuchungen zur Identifizierung der ursächlichen Mutation in der Mauslinie MVD013 durchzuführen und die pathologischen Auswirkungen zu charakterisieren, um so ihre Eignung als Tiermodell für Polycythämie und Tumorerkrankungen zu evaluieren. Mittels der durchgeführten Grob- und Feinkartierungen wurde die Lage der ursächlichen Mutation auf Chromosom 5, 59,3-89,7 Mb eingegrenzt. Durch Sequenzanalyse der Kandidatengene Kit, Pdgfra und Kdr konnte keine Mutation im kodierenden Bereich dieser Gene nachgewiesen werden. Die mutante Mauslinie MVD013 wurde im Jahr 2008 im Primärscreen der Deutsche Mausklinik untersucht. Zusammen mit den zusätzlichen sekundären Untersuchungen wurde eine umfassende Phänotypbeschreibung der Mauslinie MVD013 erstellt. Die hämatologische Analyse zeigt ein der humanen Polycythämia vera entsprechendes Blutbild, mit leichter Abweichung vom typischen PV Befund in Richtung Thrombozytopenie. Die klinisch-chemischen Untersuchungen ergaben deutlich erniedrigte Glukosespiegel und Eisenkonzentrationen im Plasma der mutanten Tiere. Die Ergebnisse der Analyse zusätzlicher Parameter des Eisenstoffwechsels und die Ergebnissen des intraperitonealen Glukosetoleranztests deuten auf einen erhöhten Eisen- und Glukoseverbrauch bei mutanten Tieren hin. Anhand der Analyse der Blutgasparameter und der Erythropoetinkonzentration im Serum wurde das Vorliegen einer sekundären Erythrozytose ausgeschlossen. Die Untersuchungen der hämatopoetischen Vorläuferzellen geben einen Hinweis auf myelosuppressive Prozesse im Knochenmark der gealterten mutanten Tiere, was mit Symptomen der humanen Post-Polycythämia vera Myelofibrosis vergleichbar ist. Die mutanten Tiere der Linie MVD013 entwickeln gastrointestinale Stromatumoren in Magen und Darm sowie eine Dilatation (Megaceacum) im Bereich des Blinddarms. Somit kann die dominant mutante Mauslinie MVD013 als ein vielversprechendes Mausmodell für Polycythämia vera, gastrointestinale Stromatumoren und pathologische Veränderungen mit Störungen der Darmperistaltik dienen.

Wed, 11 Jan 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16586/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16586/1/Gruner_Christian.pdf Gruner, Christian ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemi

Fri, 26 Mar 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11463/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11463/1/Gonzalez_Barbara.pdf González Carvajal, Bárbara

In der Therapie des Urothelkarzinoms treten nach transurethraler Resektion (TUR) in nahezu 80% aller Fälle Rezidive durch disseminierte Tumorzellen auf. Die sofortige Instillation von Mitomycin C reduziert diese Rezidivrate zwar um 39%, dennoch kommt es zu einem Wiederauftreten des Blasentumors bei 15–40% aller Patienten innerhalb von 5 Jahren nach TUR. Ziel dieser Studie war daher die Entwicklung eines orthotop xenotransplantierten Mausmodells zur Bewertung einer neuen adjuvanten Therapiestrategie. Die zur Modelletablierung verwendete Luciferasetransfizierte humane Blasenkarzinom-Zelllinie EJ 28-luc weist mit 5,1 x 105 EGFR-Molekülen pro Zelle eine deutliche Überexpression des EGF-Rezeptors auf. Eine Überexpression des EGFR wird in bis zu 86% aller Urothelkarzinome beobachtet. Als therapeutisches Agens wurde der hoch zytotoxische α-Emitter 213Bi (HWZ 45,6 min), gekoppelt an einen monoklonalen anti-EGFR-MAk (EMD 72000), verwendet. Aufgrund einer geringen Reichweite im Gewebe von ca. 50-90 μm und einem hohen linearen Energietransfer (LET) von 60-150 keV/μm eignen sich die von 213Bi emittierten α-Partikel zur effizienten Abtötung einzelner Tumorzellen oder kleiner Tumore. Zur Bewertung der therapeutischen Effizienz sowie der Toxizität der 213Bi-anti-EGFR-Konjugate wurden Tumorentwicklung und Überleben orthotop xenotransplantierter Tiere nach intravesikaler Instillation der Radioimmunkonjugate untersucht. Zur Erfassung der Tumorentwicklung wurden nicht invasive bildgebende Verfahren wie Ultraschall, 11C-Cholin-PET und Biolumineszenz Imaging verglichen. Ausschliesslich mittels Biolumineszenz Imaging liess sich eine Tumormanifestation ab dem 7. Tag nach intravesikaler Zellinstillation sowie eine posttherapeutische Tumorregression zuverlässig nachweisen. So betrug die Tumorangehrate nach intravesikaler Instillation der EJ 28-luc Zellen nahezu 80%. Die Biodistribution von 213Bi-anti-EGFR-Konjugaten, welche hochspezifisch an EJ 28-luc Zellen binden, wurde nach intravesikaler Instillation an tumorfreien und an tumortragenden Tieren untersucht. Dabei zeigte sich eine sehr gute Retention des Radioimmunkonjugats in der Blase mit vernachlässigbarer systemischer Verteilung. Die therapeutische Effizienz der 213Bi-anti-EGFR-Konjugate wurde in Abhängigkeit von der applizierten 213Bi-Aktivität und dem Zeitpunkt der Applikation nach intravesikaler Instillation der Tumorzellen im Vergleich zu einer untherapierten Kontrollgruppe ermittelt. Der Median der Überlebenszeit der Tiere, die mit 0,37 bzw. 0,925 MBq 213Bi-anti-EGFR-MAk 1 h nach Zellinstillation therapiert wurden, lag mit >300 d hochsignifikant über dem Median des Überlebens untherapierter Kontrolltiere von nur 41 d. Bei intravesikaler Instillation von 213Bi-anti-EGFR-MAk am Tag 7 nach Zellinokulation lag der Median der Überlebenszeit bei Applikation von 0,925 MBq ebenfalls bei >300 Tagen, während sich bei 0,37 MBq kein signifikanter Unterschied zum Überleben der Kontrollgruppe ergab (medianes Überleben 49 d). Bei Einsatz von 0,925 MBq 213Bi-anti-EGFR-MAk 14 d nach Zellinstillation betrug der Median der Überlebenszeit 55 d. Demnach sind die Tumore 14 d nach Zellinstillation grösser als die Reichweite der α-Partikel, so dass nicht alle Zellen abgetötet werden konnten. Die intravesikale Therapie mit Mitomycin C 1 h bzw. 7 d nach Zellinstillation bewirkte mit 289 d bzw. 251 d ebenfalls ein signifikant verlängertes medianes Überleben im Vergleich zur Kontrollgruppe. Jedoch zeigten sich bei diesen Tieren pathologische Veränderungen der Niere in Form von Nephrozirrhosen, die nach Therapie mit 213Bi-anti- EGFR-MAk nicht beobachtet wurden. Intravesikal instilliertes 213Bi-anti-EGFR Radioimmunkonjugat erwies sich als sehr effektiv in der Abtötung disseminierter Tumorzellen und verursachte keine makroskopisch erkennbare Schädigung des murinen Urothels. Diese Studie zeigte hochsignifikant verlängerte Überlebenszeiten der mit 213Bi-anti-EGFR-MAk behandelten Tiere ohne toxische Nebenwirkungen. Daher könnte sich der Einsatz intravesikal instillierter 213Bi-anti-EGFR-Radioimmunkonjugate in Patienten mit Harnblasenkarzinom nach TUR als vielversprechend im Hinblick auf ein rezidivfreies Überleben erweisen.

Durch vergleichende Analysen von Genom-, cDNA- und EST-Datenbanken konnten neue Mitglieder der murinen CEA-Familie gefunden werden, die im Rahmen dieser Arbeit genauer charakterisiert werden sollten. So wurde das Expressionsverhalten dieser neuen Mitglieder der CEA-Familie auf mRNA-Ebene in einer Vielzahl von embryonalen und adulten Normalgeweben, sowie in einigen ausgewählten Tumoren und Tumorzelllinien mit Hilfe der RT-PCR unter Verwendung von genspezifischen Primern untersucht. Die Auswertung der Versuchsergebnisse hat gezeigt, dass es erhebliche Unterschiede in der Gewebeverteilung der einzelnen Mitglieder der murinen CEA-Familie gibt. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang ist Ceacam20, das vorwiegend in den untersuchten Adenokarzinomen des Magens zu finden war. Es wird vermutet, dass CEACAM20 über ein funktionelles ITAM-Motiv direkt an der Entstehung epithelialer Neoplasien beteiligt ist. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse können als Grundlage für nachfolgende strukturelle und funktionelle Untersuchungen der neuen Mitglieder der murinen und humanen CEA-Familie gesehen werden.

Wed, 24 May 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5382/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5382/1/Roedel_Angelika.pdf Roedel, Angelika

Die Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathion-Peroxidase (PHGPx), ein Mitglied der Selen-abhängigen Glutathion-Peroxidase Familie, ist an der Detoxifikation von Sauerstoffradikalen beteiligt und übernimmt somit eine wesentliche Funktion beim Schutz des Organismus vor oxidativem Stress. Die PHGPx liegt in drei unterschiedlichen Formen, der zytosolischen, der mitochondrialen und der spermienkern-spezifischen Form vor. Durch gezielte Inaktivierung des PHGPx-Gens mittels eines konditionalen Knock-out-Mausmodells sollte deren Funktion in vivo analysiert werden. Die ubiquitäre Inaktivierung führte kurz nach der Gastrulation zu früher embryonaler Letalität (E7,5) in PHGPx-Knock-out-Embryonen. Die Knock-out-Embryonen waren in der Lage, alle drei Keimblätter, Ektoderm, Mesoderm und Endoderm, auszubilden. Ebenso war die für Mausembryonen typische Dreiteilung der Fruchtanlage durch Embryonal-, Exozölom- und Ektoplazentarhöhle erkennbar. Zu Beginn der Neurulation traten hingegen morphologische Abnormalitäten in Knockout-Embryonen auf. Diese waren charakterisiert durch hyperplastische Missbildungen vor allem in den anterioren Strukturen des embryonalen Ekto- und Mesoderms sowie im extraembryonalen Bereich. Weiterführende Studien zeigten, dass die Expression einiger für die Neurulation essenzieller Gene bei den PHGPx-Knock-out-Embryonen im Vergleich zu Wildtyp-Embryonen deutlich von anterior nach posterior verschoben waren. Dies deutet darauf hin, dass die PHGPx neben ihrer Rolle als zelluläres Antioxidans möglicherweise noch weitere Funktionen in der Regulation der Zellproliferation und Zelldifferenzierung innehat. Dies wird zurzeit anhand von primären Zellkultursystemen analysiert. Die frühe Letalität der PHGPx-Knock-out-Embryonen zeigte, dass die PHGPx eine essenzielle Funktion bereits zu Beginn der Embryonalentwicklung übernimmt. Aufgrund dieses Befunds sollte die Erstellung eines embryonalen Expressionsprofils Aufschluss darüber geben, in welchen Geweben die PHGPx exprimiert wird und bei welchen Organen bzw. Organsystemen sie in der weiteren Embryonalentwicklung beteiligt ist. Die embryonale Expressionsstudie zeigte, dass die PHGPx bis etwa Tag 12 der Embryonalentwicklung ubiquitär exprimiert war. Danach war eine starke Expression in der Leber, im Herzen und in den neuronalen Geweben zu erkennen, sowie in allen Epithelien wie beispielsweise der Lunge und des Magen-Darm-Traktes, später auch in der Haut. Bemerkenswert war ein starker Rückgang der Expression in der Leber, dem Hauptorgan der embryonalen Hämatopoese, kurz vor dem Zeitpunkt der Geburt. Dies implementiert, dass die PHGPx eine bedeutende Rolle in der Hämatopoese spielt. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die zytosolische Form der PHGPx ubiquitär exprimiert war, wohingegen die mitochondriale und die spermienkern-spezifische Formen nur im Hodengewebe detektiert werden konnten. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass ausschließlich die zytosolische Form der PHGPx essenziell für die frühe Embryonalentwicklung ist.

Nierenerkrankungen stellen aufgrund ihres häufig chronischen Verlaufs einen langen Leidensweg für den Patienten und einen nicht zu vernachlässigenden Kostenpunkt für das Gesundheitswesen dar. Die Erforschung der Faktoren, die in der Progression von Nierenerkrankungen eine Rolle spielen, ist daher nicht nur von wissenschaftlichem, sondern auch von volkswirtschaftlichem Interesse. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Erstellung eines Tiermodells, in dem die Veränderungen im Zuge der progressiven Glomerulosklerose auf Proteom- und Transkriptomsebene optimal charakterisiert werden können. Dafür wurde die Überexpression von bovinem Wachstumshormon, die reproduzierbar zu einer gut charakterisierten Kaskade von Nierenveränderung führt, in transgenen Mäusen gewählt. Zur Elimination der eventuell störenden genetischen Variabilität wurde das Modell auf dem Inzuchtstamm FVB erstellt, der keine spontanen Nephropathien aufweist. Als Promoter wurde der ubiquitär aktive cβa Promoter gewählt, wodurch zirkulierende GH-Konzentrationen in der Größenordnung von 2-4 µg/ml erreicht wurden. Um die Eignung der neuen transgenen Mauslinie für weitere Analysen zu evaluieren, wurden die auftretenden klinischen, klinisch-chemischen, makroskopisch-pathologischen und histologischen Veränderungen eingehend charakterisiert. Die GH-Überexpression führte zu einem deutlich rascheren Gewichtsanstieg unter Aufhebung des Geschlechtsdimorphismus und zu einer stark verringerten Lebenserwartung. Histologisch zeigten sich in der Niere das erwartete Spektrum renaler Alterationen, das weitgehend den in anderen GH transgenen Mauslinien beobachteten Alterationen gleicht. Anhand der histologischen Befunde und der klinisch chemischen Anzeichen einer Nierenfunktionseinschränkung, kann die progressive Nephrosklerose am ehesten als Todesursache angesehen werden. Zusammenfassend wurde mit der cβa-bGH transgenen Mauslinie zum ersten Mal ein Modell für chronisch progredientes Nierenversagen auf dem Inzuchtstamm FVB etabliert. Aufgrund der genetischen Uniformität und der in dieser Arbeit beschriebenen klinischen und histologischen Veränderungen erscheint dieses neue Modell hervorragend geeignet, um Pathomechanismen des chronischen Nierenversagens mit holistischen Untersuchungsansätzen (Transcriptomics, Proteomics) auf molekularer Ebene zu charakterisieren.