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Die vorliegende Untersuchung an noch legeinaktiven Hennen (n=116; Lohmann Classic Brown) sollte mittels wiederholten Blutentnahmen vor, während und nach diversen tierexperimentellen Eingriffen in den Energiestoffwechsel der Hennen (jeweils n≥10) einen differenzierten Einblick in den Glucose- (und Energie-) Stoffwechsel und dessen hormonale Regulation ermöglichen. So wurden zu diesem Zweck unterschiedlich ausgeprägte katabole Stoffwechselsituationen induziert: nüchtern (16 h) mehrtägig hungernd (96 h), mehrtägig hungernd (96 h) und mittels mehrmaligen Phlorizininjektionen (0,4 g/kg LM s.c.) glucosuretisch. In einem Tagesprofil (8:00-20:00) wurde der Konzentrationsverlauf von Glucose, von Metaboliten des Fettstoffwechsels (FFS, ßHB) und des Proteinstoffwechsels (Harnsäure) sowie von Insulin und Glucagon erstellt. Ein während dieser katabolen Zustände jeweils durchgeführter i.v.-Glucosetoleranztest (0,5 g/kg LM) sollte Einblick in die jeweils vorherrschende Glucoseelimination aus dem Blut und in die dabei induzierten hyperglykämischen Auswirkungen auf die Ausschüttung von Insulin und Glucagon ermöglichen. Bei nüchternen Hennen sollte mittels i.v. Glucose-Mehrfachinjektionen (0,5 g/kg LM iv) und der dadurch für zwei Stunden anhaltend erhöhten Glucoseverfügbarkeit im Blut deren Auswirkungen auf die Konzentration der bereits genannte Metabolite und Hormone im Blut dargestellt werden. Um die Wirkung einer experimentell erhöhten Insulinverfügbarkeit im Energiestoffwechsel, und zwar unbeeinflusst von einer exogenen Glucosezufuhr, bei nüchternen und hungernden Tieren darstellen zu können, wurde Tolbutamid (20mg/kg LM) i.v. injiziert und dessen Auswirkungen auf den Konzentrationsverlauf der bereits genannten Metabolite und Hormone im Blut sowie auf die Glucoseelimination aus dem Blut im Toleranztest untersucht. Als Vergleichssituation für alle Ergebnisse bei den oben genannten tierexperimentellen Maßnahmen diente der Nüchtern-Zustand (16 h) der Hennen. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 4-tägiges Hungern führt im Tagesprofil zu einem tendenziellen Anstieg der Blutglucose (12,09 mmol/l bei nüchternen Tieren vs 12,95 mmol/l bei hungernden Tieren) sowie zu einer Erhöhung der Konzentrationen von Insulin (0,56 μg/l vs 1,32 μg/l) und Harnsäure (214,9 μmol/l vs 321,7 μmol/l). Der Spiegel von ßHB (1,97 mmol/l vs 2,4 mmol/l) ist nurgeringfügig höher und der Spiegel der FFS (0,775 mmol/l vs 0,605 mmol/l) ist geringfügig niedriger im Vergleich zu nüchternen Tieren, während der Glucagonspiegel (531,8 ng/l vs 510,7 ng/l) unverändert ist. Eine durch Glucosurie verschärfte viertägige Hungersituation führt zu niedrigeren Glucose- (12,23 mmol/l) und Insulinspiegeln (0,41μg/l), einem erhöhten FFS- (0,633 mmol/l) und Harnsäurespiegel (391,6 μmol/l) und einem stark erhöhten ßHB-Spiegel (6,55 mmol/l). Glucagon ist unverändert (497,3 ng/l). Offensichtlich nutzen massiv hungernde Tiere nach 4 Tagen Hungern überwiegend Fettreserven (FFS-Oxidation) als Energiequelle, wodurch der metabolische Glucoseverbrauch erheblich reduziert werden kann. Dies zusammen mit einer deutlichen Steigerung der Gluconeogenese aus Aminosäuren dürfte dazu beitragen, dass die Glucosehomeostase auf Nüchtern-Niveau gehalten werden kann. Von hormoneller Seite wird dies offensichtlich durch einen konstanten Glucagonspiegel bei gleichzeitiger Insulinresistenz gefördert. Unterstützt wird diese Vorstellung eines durch die FFSOxidation (hohe Ketogeneserate) getragenen Energiestoffwechsels und einer durch die Gluconeogenese ganz maßgeblich getragenen Glucosehomeostase durch die Ergebnisse der glucosuretisch verschärften Hungersituation. Im Glucosetoleranztest bei nüchternen Hennen zeigt sich ein schneller Anstieg der Glucose- (12,14 mmol/l auf 26,21 mmol/l) und der Insulin- (0,93 μg/l auf 4,1μg/l) Konzentration im Blut sowie ein vorübergehender Abfall von Glucagon (547,6 ng/l auf 168,9 ng/l), FFS (0,609 mmol/l auf 0,318 mmol/l) und ßHB (0,91 mmol/l auf 0,48 mmol/l). Der Harnsäurespiegel ist unverändert. 4-tägiges Hungern ebenso wie glucosuretisches Hungern verursacht eine signifikant verzögerte Glucoseelimination (T1/2 von 8,64 min auf 12,47 min bzw. 12,3 min). Die Lipolyse-hemmende Wirkung der induzierten Hyperinsulinämie, erkennbar am Abfall des FFS-Spiegel, ist bei den hungernden sowie den hungernden und glucosuretischen Tieren vermindert (52 % bzw. 59 %). Wegen der vorübergehenden i.v. erhöhten Glucoseverfügbarkeit sinkt der Spiegel von ßHB bei hungernden Tieren auf das Nüchternniveau ab (25 %). Bei glucosuretischen Tieren ist die iv-induzierte Glucoseverfügbarkeit zusätzlich belastet, so dass der stark erhöhte ßHB-Spiegel nur mäßig (58 %) gesenkt wird. Der Harnsäurespiegel lässt sich bei keinem der induzierten Stoffwechselzustände durch die Glucoseinjektion beeinflussen. Eine durch Glucose-Mehrfachinjektionen erhöhte i.v. Glucoseverfügbarkeit bei nüchternen Tieren verursacht im nachfolgenden Glucosetoleranztest ein erniedrigtes Insulinmaximum (3,11 μg/l ), aber eine nur geringgradig verzögerte Glucoseelimination aus dem Blutplasma(T1/2 8,83 min vs 8,64 min). Im Vergleich zu ausschließlich nüchternen Hennen führen wiederholte Glucosegaben zu einer Absenkung der Spiegel von ßHB und FFS. Auch der Glucagonspiegel erfährt eine deutliche Absenkung. Tolbutamid induziert ebenso wie beim Mensch auch beim Huhn eine vorübergehende Hyperinsulinämie. Auch wenn im Vergleich zum Glucosestimulus das Insulinmaximum schwächer ausgeprägt ist, wird im Hungerzustand doch ebenfaqlls eine Reduktion in der Insulinantwort sichtbar im Vergleich zu nüchternen Tieren. Die gleichzeitige Senkung des Blutzuckerspiegels ist nur mäßig (50 % des Ausgangswertes bei nüchternen Tieren, 58 % bei hungernden Tieren). Trotz der geringeren Insulinausschüttung nach Tolbutamidapplikation wird der Glucagonspiegel ähnlich wie im Glucosetoleranztest abgesenkt. Eine zusätzliche hemmende Wirkung auf die Glucagonsekretion durch Tolbutamid scheint möglich. Der Spiegel der FFS im Blutplasma nach Tolbutamidgabe wird analog zu den Ergebnissen nach Glucoseinjektion durch den jeweiligen Insulinkonzentrationsanstieg gesenkt, wobei wiederum dieser Effekt bei den hungernden Tieren geringer ausfällt. Dies zusammen mit der nur mäßigen Insulinwirkung auf den Glucosespiegel kann als weiterer Beleg für das Vorhandensein einer Insulinresistenz im Hungerzustand gewertet werden. Der Befund, dass der ßHB-Spiegel trotzt weitgehend unveränderter Glucoseverfügbarkeit nach 30 min sinkt und erniedrigt bleibt, lässt eine Hemmung der Ketogenese durch Tolbutamid möglich erscheinen. Alle Ergebnisse werden unter Einbindung des bisher publizierten Kenntnisstandes zum Energiestoffwechsel und dessen hormonaler Regulation beim Huhn diskutiert. Dabei deuten viele Fakten, auch aus der vorliegenden Untersuchung, darauf hin, dass der Stoffwechsel des Huhnes „Glucagon-getragen“ ist. So überschreiten im Blut die Spiegel von Glucagon die von Insulin oftmals deutlich, was vermuten lässt, dass Vögel normalerweise in einer katabolen, Glucose sparendenden Stoffwechselsituation leben, vergleichbar mit der bei diabetischen, hungernden oder körperlich aktiven Säugetieren. Wahrscheinlich resultiert aus dieser speziellen Stoffwechselsituation heraus der besonders hohe Normal-Blutzuckerspiegel der Vögel und gleichzeitig die Fähigkeit, auch unter diversen Belastungen des Energiehaushaltes (z.B. nüchtern, hungernd, glucosuretisch) den Glucosespiegel unverändert hoch zu halten.

Die hyperakute Abstossung stellt die unmittelbarste Hürde für die Leber-Xenotransplantation dar. Das Ziel dieser Arbeit war es die Bedeutung verschiedener Zellpopulationen für die Bildung von freien Radikalen während der hyperakuten Abstossung der xenotransplantierten Leber zu untersuchen. Wir befassten uns mit der Frage ob es einen Zusammenhang zwischen der FR-Freisetzung und der hyperakuten Abstossung gibt und welche Zellpopulationen hauptverantwortlich für den oxidativen Schaden während der hyperakuten Abstossung sind. In einem etablierten Xenoperfusions-System wurden Rattenlebern mit Perfusaten bestehend aus gezielt-isolierten Zellgruppen reperfundiert. Hierbei evaluierten wir ein Leukozytenfiltersystem und wendeten zur Thrombozytengewinnung ein validiertes Separations/Zentrifugationsprotokoll an. Sowohl die physiologische Zusammensetzung der Perfusate, als auch die physiologische Funktion der Zellen konnten durch Coulter Counter, P-Selektin Flowzytometrie und histologische Untersuchungen gewährleistet werden. Zur Erfassung der FR-Produktion, wurden die Lipidperoxidation, NO Abbauprodukte anhand der Griess–Reaktion, Peroxynitrikonzentration und der antioxidative Status mittels Glutathionkonzentration analysiert. Durch die Verwendung dieser Messmethoden, ließen sich freie Radikale nicht direkt messen und mögliche Zwischenprodukte oder Reaktionsschritte nicht vollständig erfassen, aber die Bestimmung derer stabilen Endprodukte bot uns die Möglichkeit auch ohne Hinzufügen von Chemikalien in das Perfusionssystem ein umfassendes Bild des oxidativen Stresses zu erfassen. Die Organfunktion wurde mittels der Galleproduktion und der Freisetzung von Leberenzyme kontrolliert. Der Potaldruck war ein wichtiger Messparameter für die Makrohämodynamik. Nach Ende der Perfusion wurden Gewebeproben zur histologischen Aufarbeitung mit der HE-, Esterase- und Komplementfärbung zum Nachweis der hyperakuten Abstossungsreaktion entnommen. Folgende Ergebnisse konnten wir zusammenfassend aus unseren Daten gewinnen: In unserem Modell der perfundierten Rattenleber gab es einen signifikanten Unterschied bezüglich der Freisetzung von ROS/RNS zwischen der isogenen und xenogenen Reperfusion mit Vollblut. In den xenogen perfundierten Gruppen hatten wir trotz Zeichen einer Komplementaktivierung, d.h. einer hyperakuten Abstossung, in den Versuchsgruppen mit geringen FR-Konzentrationen eine Reduktion der Leberschäden beobachtet. Wir konnten daraus folgern, die ROS-Bildung im engen Zusammenhang mit der Leberfunktion, dem Zellschaden und der hyperakuten Abstoßungsreaktion stand. Wir konnten in unserem Modell nun erstmals zeigen, dass die Aktivierung des Komplementsystems nur bei gleichzeitiger Anwesenheit von Leukozyten zur Freisetzung von radikalen Stickstoff- und Sauerstoffspezies führt, die dann wiederum die Schädigung des Gewebes und die Dysfunktion des Transplantates verursachen. Es gab signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Zellpopulationen hinsichtlich der Freisetzung von FR in unserem Xenotransplantations-Modell. Unsere Daten weisen darauf hin, dass in der Frühphase der hyperakuten Abstossung weder Erythrozyten noch Thrombozyten oder Hepatozyten eine große Rolle in der Freisetzung von FR spielen. Es ließen sich in den Erythrozyten-und Thrombozytengruppen keine signifikanten Unterschiede zur isogen perfundierten Kontrollgruppe finden. Hauptsächlich für den oxidativen Schaden - also Freisetzung von ROS und RNS - verantwortlich waren in unserem Modell die Leukozyten und in einem geringeren Maße die Kupfferzellen, aber nur in Kombination mit den Leukozyten. Die Leukozytendepletion durch die Filtration wirkte am protektivsten auf die Organfunktion, wogegen die Depletion von KC, nur die ROS-Freisetzung reduzierte, aber keinen protektiven Einfluss auf den Grad der hyperakute Abstossung und Organschädigung hatte. Die Anwesenheit von KC dagegen scheinen NO abzufangen und wirken bezüglich RNS protektiv. Unsere Daten tragen zu dem Verständnis der frühen Vorgänge und insbesondere der Rolle der Freien Radikale während der hyperakuten Abstossung in der Xenotransplantation der Leber bei. Eine Inhibierung oder Modulation der ROS-Freisetzung könnte eine viel versprechende Basis für einen therapeutischen Ansatz der hyperakuten Abstossung darstellen. Inwieweit eine gezielte pharmakologische Hemmung der Leukozytenaktivität und der Einsatz von FR spezifischen Scavengern zu einer Verminderung der hyperakuten Abstoßung von Xenotransplantaten bewirken können, bleibt Inhalt künftiger Untersuchungen.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt weltweit zu den häufigsten Karzinomen, in Europa macht es zwar nur 3% der Karzinome aus – jedoch mit steigender Inzidenzrate. Diese ist möglicherweise auf eine Infektionswelle mit Hepatitis B und C von 1950 bis 1980 zurückzuführen (29, 125). Daneben zählen chronischer Alkoholabusus, Aflatoxin B1-Exposition und Leberzirrhose per se zu den Hauptrisikofaktoren für die Entstehung des hepatozellulären Karzinoms. Die Kenntnisse der molekularen Mechanismen der Karzinogenese in der Leber, insbesondere der Dysregulation von Proliferation und Apoptose sind indessen noch sehr lückenhaft. Die vorgelegte Arbeit wurde mit dem Ziel durchgeführt, einen Beitrag zur Klärung der formalen und molekularen Pathogenese der Hepatokarzinogenese zu leisten. Es wurde das Proliferations- und Apoptoseverhalten im hepatozellulären Karzinom (HCC, n=52) über immunhistochemische Verfahren und TUNEL-Hybridisierung untersucht. Dabei wurde die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67, der Zellzyklus- und Apoptosekontrollproteine Fas-Rezeptor (Fas), Fas-Ligand (FasL), bax, bcl-2, p53 und der Apoptosemarker M30 und TUNEL mit normalem Referenzgewebe (RG, n=61), dysplastischen Knoten (DN, n=9), einem hepatozellulären Adenom (HCA, n=1), makroregenerativen Knoten (MRN, n=5), fokaler nodulärer Hyperplasie (FNH, n=3), undifferenzierten Karzinomen (n=2), einem cholangiozellulären Areal eines Kollisionstumors (n=1) und Metastasen primärer Lebermalignome (n=3) verglichen. Fragen waren dabei, - ob bestimmte Expressionsmuster der untersuchten Zellzyklus- und Apoptose-regulatoren kennzeichnend für die Hepatokarzinogenese sein könnten, - ob sich Hinweise auf eine Adenom-Karzinom- oder Dysplasie-Karzinom-Sequenz ergeben, - ob interindividuelle Unterschiede zwischen HCC abhängig von Ätiologie, histologischem Differenzierungsgrad, Tumorgröße, pT-Stadium und Morphologie bestehen und sich daraus Rückschlüsse auf ein jeweils charakteristisches tumorbiologisches Verhalten ziehen lassen, - ob sich aus den Ergebnissen relevante Schlussfolgerungen für Diagnostik und Therapie des Hepatozellulären Karzinoms ableiten lassen. Damit wird mit dieser Arbeit erstmalig eine komplexe Beleuchtung des Proliferations- und Apoptoseverhaltens im hepatozellulären Karzinom und in anderen Veränderungen der menschlichen Leber vorgelegt, die so bisher nicht vorgenommen wurde. Folgende Ergebnisse waren in der Auswertung der immunhistochemischen Untersuchungen festzustellen: HCC zeigten eine signifikant gesteigerte Ki-67-Expression, TUNEL-Positivität, bax-Expression, sowie eine signifikant verminderte Fas- und FasL-Expression gegenüber normalem Referenzgewebe (RG) (p

Ziel dieser Arbeit war zu überprüfen, inwieweit sich der Nasenwiderstand während der aktiven Dehnung mit einer Gaumennahterweiterungsapparatur (GNE) verändert. Dabei wurden 37 Patienten im Alter von 8-19 Jahren (Mittelwert = 11,27 Jahre) untersucht, bei denen aufgrund einer skelettalen transversalen Diskrepanz des Oberkiefers eine Gaumennahterweiterung indiziert war. Aussagefähige und objektive Ergebnisse über die Durchgängigkeit der Nasenpassage wurden mit Hilfe der anterioren Rhinomanometrie gewonnen (Flow – Wert in ml/s). Um einen gewissen „Standardzustand“ zu erreichen, erhielt jeder Patient zehn Minuten vor der eigentlichen Untersuchung einen vasokonstringierenden Alpha-Blocker (Privin®). Alle Untersuchungen wurden nur von mir, an immer dem gleichen Rhinomano-metriegerät in der Poliklinik für Kieferorthopädie der LMU München, durchgeführt. Um die Öffnung der Sutura palatina media sicherzustellen, wurde bei allen Patienten eine röntgenologische Aufbissaufnahme angefertigt. An folgenden Untersuchungszeitpunkten wurden Messungen durchgeführt: 1. vor Einsetzen der GNE 2. direkt nach Diastemaöffnung, d.h. nach Öffnung der Sutura palatina media 3. am Ende der aktiven Drehung 4. vier Wochen nach Dehnungsende Zusätzlich zur rhinomanometrischen Messung wurde vor Einsetzen der Gaumen-nahterweiterungsapparatur und ein Jahr später ein Fernröntgenseitenbild (FRS) angefertigt. Dabei sollten Veränderungen hinsichtlich einer Abnahme der adenoiden Wucherungen, induziert durch die Gaumennahterweiterung, untersucht werden. Folgende Ergebnisse sind aus den durchgeführten Untersuchungen gewonnen worden: Es ist schon frühzeitig bei Suturöffnung eine signifikante Verbesserung der Flow – Werte zu verzeichnen (Inspiration von 7,5 % und bei Exspiration um 7,8%). Bei Fortführung der Dehnung erfolgte eine weitere Verbesserung der als Korrelat für die Nasenatmung geltenden Flow – Werte (Inspiration von 3,1%, Exspiration von 3,2%). Eine Verbesserung von insgesamt 10,6% bei Inspiration und 11,0% bei Exspiration konnte dabei verzeichnet werden. Eine im Verhältnis größere Verbesserung konnte bei Patienten mit stärkerer Obstruktion (Verbesserung von 26,5%) festgestellt werden. Je höher die Atmungsbehinderung war, desto größer war die Reduktion des Nasenwiderstandes, die durch die Gaumennahtdehnung hervorgerufen wurde. Es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Atmungsbehinderung und der Größe der Verbesserung. Hingegen konnte keine direkte Korrelation zwischen Dehnungsweite und Verbesserung der Flow – Werte gefunden werden. Die erreichte Verbesserung der Nasenatmung blieb auch vier Wochen nach Dehnungsende stabil. Die Auswertung der Fernröntgenseitenbilder nach LINDER-ARONSON ergab eine 9,7%ige Volumenzunahme des posterioren Nasenrachenraumes bei den 29 untersuchten Patienten (Alter im Median 10 Jahre). Eine eindeutige Klärung, inwiefern die physiologische Verringerung des lymphatischen Gewebes oder die durch die Gaumennahtdehnung induzierte bessere Belüftung kausaler Faktor für die Zunahme des Respirationstraktes ist, war hierbei nicht möglich. Um dennoch eine Aussage über die Ursache der Zunahme des Nasenrachenraumes treffen zu können, wurden zwei Untersuchungsgruppen gebildet. Eine Gruppe (≤12 Jahre), in der die physiologische Veränderung des lymphatischen Gewebes noch zu erwarten war, und die zweite Gruppe (>12 Jahre) in der der physiologische Rückgang bereits als weitgehend abgeschlossen angesehen werden konnte. In beiden Gruppen konnte eine Vergrößerung der Ausdehnung des Nasenrachenraumes verzeichnet werden. Daraus kann geschlossen werden, dass durch die bessere Belüftung, induziert durch die GNE, eine Verringerung adenoider Wucherungen zu erwarten ist. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Gaumennahterweiterung schon frühzeitig einen positiven Effekt auf die Nasenatmung aufweist und eine effektive Behandlungsmethode zur Verbesserung der Nasenpassage mit Korrektur transversaler Diskrepanzen im Oberkiefer darstellt. Dabei sollte jedoch berücksichtigt werden, dass eine effektive Verbesserung der Nasenatmung nur bei Patienten, die eine Verengung im anterioren und kaudalen Anteil der nasalen Strukturen aufweisen, erzielt werden kann. Bei Patienten, die unter nasalen Polypen, Hypertrophie der Nasenwege, ausgeprägten adenoiden Wucherungen und einer Septumdeviation mit totaler Verlegung der Atemwege leiden, ist eine alleinige Therapie mit einer Gaumennahterweiterung zur Verbesserung der Atmung nicht sinnvoll, sondern kann nur unterstützend zu einer HNO-ärztlichen Therapie angewendet werden. Eine enge interdisziplinäre Zusammenarbeit zwischen Kieferorthopäde und Hals-Nasen-Ohren-Arzt sollte somit angestrebt werden.

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion, Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden, sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B. focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw. induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig. Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids, welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42 können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1- und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen. Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw. einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1 im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade. Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2, ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.

Für die Mast von Pekingenten wird eine Haltung mit der Möglichkeit gefordert, das arteigene Badeverhalten ausüben zu können. Dies setzt ein Angebot von Tränkesystemen voraus, die es den Tieren ermöglichen, den Ablauf der dafür notwendigen Handlungskette durchzuführen. Ziel der vorliegenden Studie ist es zu untersuchen, inwieweit verschiedene Tränkesysteme in der Lage sind, unter den Gegebenheiten und Managementbedingungen eines Großbetriebes mit insgesamt 161000 Enten Mastkapazität pro Stallkomplex, die Ansprüche der Tiere hinsichtlich der Ausübung ihres Badeverhaltens zu realisieren. Zu diesem Zwecke wurden über den Zeitraum Mai 2003 – Juni 2004 (=12 Mastdurchgänge) in drei Stallabteilen mit einem Besatz von je 3600 Tieren neben einem konventionellen Nippelstrang den Tieren entweder Plassontränken, Sparkcuptränken oder Wasservernebelung mittels Düse in Kombination mit Nippeltränken jeweils als Alternative angeboten. Als Kontrolle diente ein identisches Stallabteil mit gleichem Tierbesatz und zwei Nippelsträngen. Als Beurteilungsparameter für den Systemvergleich diente die Feststellung der Frequentierung der einzelnen Tränkesysteme mittels 2 x 12 Std. Videoaufzeichnung pro Mastdurchgang, die Beurteilung des Befiederungszustandes, der Konjunktiven und Nasenöffnungen am Ausstallungstag sowie die Erhebung von Produktionsparametern wie Verlustrate, Gewichtszuwachs, Stroh- und Wasserverbrauch. Um einen möglichen Einfluss der verschiedenen Tränkesysteme auf die Stallumwelt zu erfassen, wurde neben dem Stallklima und NH3 Gehalt der Stallluft die Einstreuqualität bonitiert. Ferner wurde der mikrobiologische Zustand des Tränkwassers in den Systemen Plasson- und Sparkcuptränken sowie der Einstreu aller Stallabteile kontrolliert. Folgende Ergebnisse konnten statistisch (p < 0,05) gesichert werden: · Plassontränken wurden von den Tieren gegenüber Nippeltränken bevorzugtaufgesucht. · Sparkcuptränken wurden signifikant weniger häufig genutzt als Nippeltränken. · wurden die Nippeltränken mit intermittierender Wasservernebelung durch Düsen kombiniert, führte das zu einer signifikanten Bevorzugung gegenüber der nicht bedüsten Nippeltränkereihe durch die Tiere. · die Einstreuqualität im mit Plassontränken ausgestatten Stall war signifikant schlechter als in den übrigen Ställen. · lagen die Verluste im mit Sparkcuptränke ausgestatteten Stall mit 2,16% über der Kontrolle mit 1,55%. Tendenziell · lagen die Verluste im mit Plassontränken ausgestatteten Stall mit 2,11% über der Kontrolle mit 1,55% (P = 0,056). · lag die Häufigkeit von Tieren ohne den Befund verklebter Nasenöffnungen in der Sparkcupvariante mit 51% über der Plassonvariante mit 32% (P=0,058). Umgekehrt lag die Befundhäufigkeit von zwei verklebten Nasenöffnungen in der Plassonvariant mit 37% über der des Kontrollstalles mit 18% (P=0,058). Kein gesicherter Zusammenhang bestand in den vorliegenden Untersuchungen zwischen den einzelnen Tränkevarianten und den Produktionsparametern Gewichtzuwachs (3,2kg/Durchgang), Strohverbrauch (57 g/Tier/Tag), Befiederungszustand nach Mastende, NH3 Gehalt der Stallluft (9,1 ppm), Enterobakteriengehalt der Einstreu ( 2,58 x 108 KbE/g Einstreu) und dem Auftreten von Konjunktivitis(61,5%). Der Gehalt an Enterobakterien im Tränkewasser von Plasson- und Sparkcuptränken lag bei 1,85 x 106 (KBE/ml). In 2 von 15 Durchgängen konnten aus dem Wasser dieser Systeme Salmonellen isoliert werden. In der Einstreu konnten bei allen Probenahmen und in allen Ställen Salmonellen verschiedener Serovaren (S. Saintpaul,S.Typhimurium, S.Kottbus, S.Indiana, S.Mbandaka) nachgewiesen werden. Stallspezifische Unterschiede bestanden dabei nicht. Insgesamt gesehen wurden von den in der vorliegenden Studie untersuchten alternativen Tränksystemen Plassontränken und Nippeltränken in Kombination mit Wasservernebelung von den Tieren gesichert gegenüber Nippeltränken bevorzugt. Bei den Plassontränken ging dies jedoch mit einer Verschmutzung des Tränkwassers und einer Durchnässung der Einstreu einher. Auf alle geprüften ökonomischen bzw. gesundheitlich relevanten Parameter ergab sich jedoch kein positiver - hinsichtlich hygienischer Aspekte eher ein negativer - Einfluss der Alternativsysteme gegenüber dem konventionellen Nippeltränkesystem.

In dieser Studie wurde die Wirksamkeit eines Poly-Vinyl-Pyrrolidon (PVP)-Jod-Komplexes zur Behandlung der Dermatitis digitalis (D.d.) überprüft. Zusätzlich wurden mögliche Zusammenhänge zwischen der D.d. und dem Bewegungsverhalten der Tiere, der Futteraufnahme und der Milchleistung untersucht. Bezüglich der Wirksamkeit des Jodkomplexes wurde die Studie als kontrollierter Versuch angelegt. Während eines Klauenpflegekurses am LVG (Lehr- und Versuchsgut der Universität München) wurden 16 Tiere ausgewählt, bei welchen D.d. in typischer Ausprägung vorhanden war. Die Tiere der Versuchsgruppe wurden während 5 aufeinanderfolgender Tage zweimal täglich mittels eines Drucksprühgerätes zuerst mit Leitungswasser zur Reinigung, danach mit der 7,5-prozentigen Jodlösung im Zwischenklauenspalt, im Fesselbereich plantar und dorsal besprüht. Die Tiere der Kontrollgruppe erfuhren die gleiche Behandlung mit Leitungswasser. Kontrolluntersuchungen fanden 6, 10 und 20 Tage nach Behandlung statt. Damit eine andere Applikationsform der Jod-Lösung getestet werden konnte, wurden 3 weitere Tiere mit „klassischen“, erosiven D.d.-Läsionen (M2) ausgewählt. Diesen wurde nach Reinigung und Trocknung ein mit der Jodlösung getränkter Tupfer auf die Veränderung gebracht und dieser mit einem Verband abgedeckt. Der Verband wurde am Versuchstag 7 entfernt und die Läsion überprüft und dokumentiert. Die Untersuchung der Schritthäufigkeit wurde mittels Pedometern durchgeführt, die an den Hintergliedmaßen im Bereich des Metatarsus angebracht wurden. Die Datenerfassung zum Bewegungsverhalten erfolgte täglich einmal zu etwa gleichen Untersuchungszeitpunkten. Tage an denen Klauenkontrollen erfolgten sowie die Daten brünstiger Tiere, wurden nicht gewertet. Die Pedometer wurden 17 Tage vor antibiotischer Behandlung angebracht. Am Versuchstag 0 erfolgte eine Untersuchung im Klauenstand, dann wurden 3 Tage lang Messungen durchgeführt. Am Tag 6 erfolgte eine erneute Kontrolle im Pflegestand. Die Läsionen wurden mit Wasser und Bürste gereinigt, getrocknet und dann mit 2 Lagen (Abstand von 30 Sekunden) eines chlortetracyclinhaltigen Sprays (Aureomycin®, Fa. Forte Dodge, Veterinär GmbH, Würselen) behandelt. An den Tagen 6, 10 und 20 wurden Kontrollen im Klauenstand vorgenommen. 10 Tiere erfüllten die Einschlusskriterien zu Beginn und über die gesamte Dauer des Versuchs. Sowohl während der Erstuntersuchung, als auch über den gesamten Beobachtungszeitraum zeigte keines der Tiere eine sichtbare Lahmheit. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Wiederholtes Besprühen von Läsionen mit einem 7,5 prozentigem Poly-Vinyl-Pyrrolidon-Jod-Komplex war zur Behandlung der Dermatitis digitalis unwirksam. 2. Eine Anwendung unter Verband erbrachte keinen deutlichen Erfolg. 3. Die Schrittzahl pro 24 Stunden an den 3 Tagen vor Behandlung lag im Mittel bei 3901 Schritten (Stdv. 1233), der Mittelwert über 3 Tage nach Behandlung bei 3444 Schritte (Stdv. 955) pro 24 Std. (p>0,05). Es konnten somit keine signifikanten Veränderungen in der Schrittzahl pro 24 Stunden beim Vergleich der Zeiträume vor und nach einer Behandlung mit Chlortetracyclinspray bei an Dermatitis digitalis erkrankten Rindern erkannt werden. 4. Die Grundfutteraufnahme lag vor der Behandlung im Mittel bei 28,60 kg (Stdv. 6,17), nach Behandlung lag dieser Wert bei 25,43 kg (Stdv. 4,97); p

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene physiologische Parameter hinsichtlich ihres Einflusses auf die Kolonisierungs- und Plasmidtransfereffizienz von P. chlororaphis SPR044 in der Rhizosphäre von A. thaliana zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden TnMod-Insertionsderivate mit Veränderungen "Quorum-Sensing"-regulierter Funktionen untersucht. Darüber hinaus sollten Auswirkungen von pJP4 auf die Fitness von SPR044 festgestellt werden. Weiterhin sollte eine Strategie zur in situ-Detektion plasmid-tragender Stämme in der Rhizosphäre entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Das natürliche Isolat P. chlororaphis SPR044 produzierte BHSL, 3-OH-OHSL und ein weiteres, bisher nicht identifiziertes Acyl-HSL. Alle drei Acyl-HSLs wurden ebenfalls von den PCN-negativen SPR044-Derivaten sowie vom PCN-Überproduzierer produziert, nicht jedoch von den "Quorum-Sensing"-negativen Derivaten. Entsprechend der regulatorischen Funktion der Acyl-HSLs zeigten quantitative Analysen eine Korrelation zwischen der Menge von produzierten Acyl-HSLs, antimikrobiellen Metaboliten und extrazellulären Proteasen. Die einzige Ausnahme bildete der PCN-Überproduzierer. Dessen PCN-Überproduktion basiert vermutlich auf einer Veränderung des LPS und nicht auf der Ausschaltung eines negativen Regulators. In Einzelkultivierungs-Experimenten zeigte sich nach 14 Tagen kein Unterschied zwischen den Populationsgrößen des Wildtyps und der Derivate. Nach 28 und 42 Tagen war die Population des Wildtyps gleich groß wie die des PCN-negativen Derivats und signifikant größer als die des gacS-negativen Derivats und des PCN-Überproduzierers. In Kokultivierungs-Experimenten war die Population des gacS-negativen Derivats hingegen stets gleich groß wie die des Wildtyps. Eine Erklärung dieses Phänomens konnte durch Untersuchung der Wachstumskinetiken in Flüssigkultur erbracht werden. Die "Quorum-Sensing"-negativen Derivate wiesen eine stark verkürzte Lag-Phase und eine reduzierte Produktion des für die stationäre Phase spezifischen Sigmafaktors Rpos auf. Dies führte nach Koinokulation mit anderen Bakterien offenbar zu einer Aufhebung des selektiven Nachteils. Vermutlich nutzen die gacS-negativen Stämme komplexe C-Quellen, die durch die Enzyme des Wildtyps zugänglich gemacht werden und profitieren darüber hinaus von der verkürzten Lag-Phase. Die Frequenz des konjugativen pJP4-Transfers von SPR044 zu R. eutropha ist unabhängig von "Quorum-Sensing"- und PCN-Produktion. Die Transformation mit pJP4 per se hatte keinen negativen Einfluss auf die Rhizosphäre-Kolonisierungseffizienz von SPR044. Lag jedoch zusätzlich abiotischer oder biotischer Stress vor, manifestierte sich die metabolische Last durch pJP4 in einer verringerten Populationsgröße. Dieser Effekt war unabhängig vom "Quorum-Sensing"-System und der PCN-Produktion von SPR044. VirB5 von A. tumefaciens assembliert in einer höhermolekularen Struktur, die durch Scherkräfte von der Zelle gelöst und mittels Ultrazentrifugation sedimentiert werden kann. Bei verschiedenen Reinigungsschritten wurde eine Kofraktionierung mit der Haupt-Piluskomponente VirB2 beobachtet. VirB5 ist somit eine Nebenkomponente des T-Pilus. Das homologe Protein TraC aus dem IncN-Plasmid übt vermutlich eine ähnliche Funktion in pKM101-determinierten Pili aus. Zellfraktionierung pJP4-tragender P. chlororaphis-Zellen und Detektion mit spezifischen Antiseren deuten darauf hin, dass TrbC und TrbF Haupt- und Nebenkomponente pJP4-determinierter Pili sind. Bei TrbH handelt es sich um ein membran-assoziiertes Lipoprotein. Die Detektion pJP4-tragender Bakterien aus der Rhizosphäre war mit den TrbF- und TrbH-spezifischen Antiseren in situ möglich. Das TrbF-spezifische Antiserum ermöglichte die Erkennung IncP-Plasmid-tragender Bakterien. Das TrbH-spezifische Antiserum ermöglichte eine zusätzliche Unterscheidung zwischen IncPa- und IncPß-Plasmid-tragenden Zellen. Eine Kombination der Immunfluoreszenz-Analyse mit FISH erwies sich als geeignet für die Detektion von pJP4-Transfer zwischen SPR044 und R. eutropha in der Rhizosphäre von A. thaliana.

Ziel dieser Arbeit war es, die aus der Genomsequenz von M. jannaschii identifizierten Komponenten der Biosynthese und Inkorporation von Selenocystein biochemisch und molekularbiologisch zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: a) Die tRNASec von M. jannaschii konnte mit gereinigter Seryl-tRNA-Synthetase von E. coli korrekt in vitro mit L-Serin beladen werden. Die Umwandlung der Seryl-Gruppe in eine Selenocysteyl-Gruppe war mit gereinigter Selenocystein-Synthase und Selenophosphat- Synthetase von E. coli ebenfalls erfolgreich. In Extrakten von M. jannaschii konnte darüber hinaus die Selenocystein-Synthase-Aktivität nachgewiesen werden. Eine rekombinante tRNASec von M. maripaludis, bei der eine Base im Anticodon-"Loop"ausgetauscht worden war, konnte im heterologen Wirt E. coli Selenocystein inserieren. b) Die Natur und die Lokalisation des archaeellen SECIS-Elements konnte durch die heterologe Expression eines Selenoprotein-Gens von M. jannaschii in M. maripaludis bewiesen werden. Die heterologe Selenoprotein-Synthese war dabei abhängig vom Vorhandensein und der strukturellen Unversehrtheit des RNA-Elements in der 3'-nicht-translatierten Region der Selenoprotein-mRNA. c) Die biochemische Charakterisierung des heterolog in E. coli überproduzierten MJ0495- Proteins von M. jannaschii ergab Dissoziationskonstanten für Guanin-Nukleotide, wie sie für bakterielle SelB-Spezies typisch sind. Darüber hinaus diskriminiert das MJ0495-Protein zwischen der kognaten Ser-tRNASec und Sec-tRNASec; letztere wird mit höherer Affinität gebunden. MJ0495 stellt deshalb den Selenocystein-spezifischen Translationsfaktor in Archaea (aSelB) dar. Das in der nicht-translatierten mRNA-Region liegende SECIS-Element wird allerdings (im Unterschied zu SelB von E. coli) nicht von aSelB gebunden. d) Es konnten mehrere SECIS-bindende, und ein aSelB-bindendes Protein identifiziert werden, die möglicherweise für die notwendige Kommunikation zwischen aSelB und dem SECISElement sorgen. e) Durch die Proteomanalyse konnte gezeigt werden, dass in M. maripaludis einige Proteine in Abhängigkeit von der Selenversorgung gebildet werden. Dabei wurden auch solche Proteine selenabhängig synthetisiert, die kein Selenocystein enthalten.

Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa. Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten. Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis, Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y. enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y. enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion (durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y. enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-, GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3- Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort: schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y. enterocolitica-Infektion initiiert.

Der bei einem Genbank-Screening identifizierte Genlocus ydeD kann bei Überexpression die Ausbeute eines Cystein-Produktionsstammes von Escherichia coli deutlich verbessern. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das bisher unbekannte ydeD-Gen möglichst umfassend in seiner Biochemie und Physiologie zu charakterisieren, um damit einen Beitrag zur Steigerung der Cystein-Produktion zu liefern. Folgende Ergebnisse wurden dabei erhalten: 1. Es konnte gezeigt werden, daß es sich bei dem ydeD-Genprodukt um ein integrales Membranprotein handelt, das zu einer neuen Familie von putativen Effluxsystemen gehört. Desweiteren wurde das Translationsstartcodon des Gens eindeutig bestimmt. 2. Die Überproduktion von YdeD führte in Wildtypstämmen von E. coli dazu, daß das Wachstum in Minimalmedium erst nach Supplementation mit Thiosulfat und Methionin möglich war. Es wurde gezeigt, daß die Ursache für die Unfähigkeit zur Sulfat-Reduktion in einem intrazellulären N-Acetylserin-Mangel lag, der wiederum auf eine übermäßige O-Acetylserin (OAS)-Exkretion zurückgeführt werden konnte. In einer späteren Wachstumsphase erfolgte die Wiederaufnahme des zuvor ausgeschiedenen OAS, welches in der Zelle zu Cystein umgesetzt und anschließend wieder ausgeschieden wurde. Somit war gezeigt, daß der entscheidende Beitrag des ydeD-Genprodukts zur Cystein-Produktion in der primären Exkretion von OAS liegt. Die Frage, wie das Cystein nun ausgeschleust wird, ob als freie Aminosäure oder gebunden in der 2-Methyl-2,4-Thiazolidindicarbonsäure, der Form, in der das Cystein im Medium nachgewiesen wurde, mußte allerdings offen bleiben. 3. Bei der Analyse des Mediums nach Wachstum von YdeD-überproduzierenden Zellen wurden neben OAS und Cystein noch Asparagin und Glutamin als weitere spezifische Exkretionsprodukte identifiziert. Dieses Ergebnis sowie die strukturellen Ähnlichkeiten bei OAS, Glutamin und Asparagin, den Hauptexkretionsprodukten während der exponentiellen Wachstumsphase, legen nahe, daß es sich bei YdeD um einen Kanal oder einen energiegetriebenen Exporter für diese Verbindungen handelt. Ob auch Cystein ein direktes Substrat für YdeD darstellt, wird diskutiert. 4. Eine ydeD-Mutante zeigte keinen signifikanten Phänotyp, woraus man schließen muß, daß das Gen - zumindest unter den getesteten Bedingungen - nicht essentiell für E. coli ist. 5. Über die mögliche physiologische Funktion des ydeD-Genprodukts kann derzeit nur spekuliert werden, allerdings erscheint eine YdeD-vermittelte Aminosäure-Exkretion als Entgiftungsmechanismus unter bestimmten Streßbedingungen durchaus plausibel.