Podcasts about angiogenese

Die Induktion eines vaskulären Wachstums und Remodelings stellt einen vielversprechenden neuen Therapieansatz für Patienten mit koronarer Herzerkrankung dar. Stickstoffmonoxid (NO) nimmt in der Regulation des Blutflusses, in der Aufrechterhaltung der vaskulären Homöostase sowie als second messenger für die Induktion einer Arteriogenese und Angiogenese eine zentrale Rolle ein. Dank des Systems der druckregulierten Retroinfusion steht daneben ein komplikations- und nebenwirkungsarmes Verfahren zur Verfügung, das eine selektive, homogene und effektive Applikation von gefäßbildenden Faktoren im Myokard ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurde die retrograde Infusion von eNOS S1177D komplementärer DNA (als konstitutiv aktive Mutante) in die anteriore Koronarvene zur Induktion einer therapeutischen Revaskularisation im chronisch ischämischen, hibernierenden Myokard untersucht. Mittels perkutaner Implantation eines präparierten Koronarstents wurde zunächst eine hochgradige Stenose im proximalen LAD-Segment der linken Koronararterie herbeigeführt. Nach sieben Tagen wurde angiographisch ein Restfluss dokumentiert, um eine langsame aber stetige Abnahme der myokardialen Durchblutung bis zur vollständigen Okklusion zu gewährleisten und die Induktion einer myokardialen Hibernation mit reduzierter kontraktiler Funktion ohne schwerwiegende Infarzierung des Gewebes sicherzustellen. Drei Wochen später wurde den Tieren eNOS S1177D cDNA, eNOS S1177D und L-NAME (unspezifischer NO-Inhibitor) oder eGFP cDNA als Scheintransfektion retrograd in die anteriore Koronarvene infundiert (n,=,6 pro Gruppe). Sowohl am Behandlungstag als auch am Tag,49 der Untersuchung (Versuchsende) wurden Parameter der globalen Herzfunktion bestimmt. Zur Analyse der regionalen myokardialen Perfusion dienten fluoreszierende Mikrosphären; die Bestimmung der regionalen Myokardfunktion als subsegmentale Segmentverkürzung gelang mit Hilfe der Sonomikrometrie. Für das Kollateralenwachstum wurden postmortale Angiographien ausgewertet. Darüber hinaus war zur Ermittlung der Expression von eNOS, des regionalen Blutflusses und der Kapillardichte die Entnahme von Gewebeproben aus dem linken Ventrikel erforderlich. In dieser Untersuchung demonstrieren wir, dass die retrograde Applikation von eNOS S1177D cDNA über die Überexpression von eNOS ein NO vermitteltes Gefäßwachstum induziert, welches mit einer gesteigerten myokardialen Perfusion einhergeht und schließlich zu einer verbesserten kontraktilen Funktion im Zielgebiet führt. Die zum Kontrollareal 2,3-fach gesteigerte Expression von eNOS geht dabei über eine gesteigerte Bildung von NO respektive cGMP (117,1,% der RCx-perfundierten Region) neben einer Proliferation von Kapillaren (Angiogenese) insbesondere mit der Bildung von kollateralisierenden Anastomosen (Arteriogenese) einher. Aus diesem vaskulären Wachstum und Remodeling resultiert im Vergleich zur Kontrollgruppe arealabhängig eine bis zu 2,2-fach gesteigerte myokardiale Perfusion, wodurch sich die regionale Herzfunktion (subsegmentale Segmentverkürzung) bei erhöhtem Sauerstoffbedarf von 7.% auf 41,% (Herzfrequenz von 120 Schägen pro Minute) respektive 33,% (Herzfrequenz von 140 Schlägen pro Minute) des normoxischen Myokards regeneriert.

Chronische Extremitätenischämien stellen eine sowohl subjektiv belastende als auch volkswirtschaftlich bedeutende Krankheitsentität dar. Dabei können etliche Patienten mit den zur Verfügung stehenden konventionellen Verfahren nicht befriedigend therapiert werden. Neuere Konzepte zur Zelltherapie der chronischen Therapie führten in der klinischen Erprobung dabei zu eher ausbaufähigen Resultaten. Unsere Gruppe konnte in Vorarbeiten zeigen, dass die exogene Applikation embryonaler Endothelprogenitorzellen (eEPCs) im Tiermodell zu einem deutlichen Effet auf die chronische Ischämie führt. Um diesen Effekt weiter zu steigern, wurde ein künstliches Fusionsmolekül aus dem Chemokin SDF-1 als Kopf, der Mucindomäne des Fractalkine als Rückgrat und einem GPI-Teil zur Verankerung im Endothel (SDF-Fractalkine-GPI oder S1FG) kloniert. Wir konnten ebenfalls in Vorarbeiten zeigen, dass dieses S1FG eEPCs in vitro und in vivo rekrutiert, und dass eine Vortransfektion des Endothels des Ischämiegebietes vor Applikation der eEPCs zu einer Steigerung des funktionellen Effekts führt. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Ersatz der exogenen Applikation der eEPCs durch eine Mobilisierung endogener vaskulärer Progenitorzellen ebenfalls zu einem guten funktionellen Effekt führt. Weiterhin sollte der genaue Rekrutierungsmechanismus des S1FG untersucht werden. Zur Untersuchung des funktionellen Effekts wurde wie in den Vorarbeiten ein Kaninchenmodell der chronischen Hinterlaufischämie gewählt, bei dem an Tag 0 die rechte Femoralarterie entfernt wurde. Nach Entwicklung eines chronischen Zustandes wurde am Tag 7 eine Angiographie beider Femoralisstromgebiete durchgeführt und entweder S1FG oder eGFP liposomal per Retroinfusion transfiziert. An den Tagen 9, 10 und 11 wurde jeweils 1 mg des kurzwirksamen CXCR4-Antagonisten AMD3100 oder 1 ml NaCl intraperitoneal injiziert. An Tag 35 wurde eine erneute Angiographie durchgeführt, das Tier getötet und die Hinterlaufmuskulatur entnommen. Die Angiogenese wurde über die mittels PECAM-1-Färbung bestimmte Kapillardichte gemessen, die Arteriogenese über die Mengenzunahme der in der Angiografie sichtbaren Kollateralen. Zur Messung der Perfusion wurden die Flussgeschwindigkeit in der Angiographie sowie fluoreszierende Mikrosphären verwendet. Um das Rekrutierungsprofil des S1FG in vitro zu eruieren, wurden statische Adhäsionsversuche mit PMNs auf transfizierten HMECs sowie Adhäsionsversuche in Flusskammern von THP-1-Zellen auf transfizierten HUVECs verwendet. Es zeigte sich, dass signifikant weniger PMNs auf S1FG-transfiziertem Endothel adhärieren, als auf Fractalkine-transfizierten HMECs, während die eEPC-Adhäsion signifikant besser war. Bei den Versuchen unter Schubspannung ergab sich durch S1FG-Transfektion keine signifikante Änderung der Anzahl rollender Zellen, während die Anzahl fest haftender Zellen signifikant höher war. Durch Zugabe eines L-Selektin-Antikörpers zu den THP-1-Zellen vor Superfusion konnte die Anzahl fest haftender Zellen wieder auf Kontrollniveau reduziert werden, während die Anzahl rollender Zellen leicht reduziert wurde. Zugabe von AMD3100 führte dort nicht zu einer signifikanten Änderung der Anzahl adhärierender Zellen, jedoch wurde durch AMD3100 die Stärke der Interaktion, gemessen als Anzahl nach Applikation hoher Flüsse noch adhärierender Zellen, wieder auf Kontrollniveau reduziert. Ein über andere Adhäsionsmoleüle vermitteltes Zellrollen ist also vermutlich eine Voraussetzung für eine adäquate S1FG-Funktion. Dabei würde es über SDF-1-CXCR4-Interaktion zu einer Erhöhung der Festigkeit der Bindung kommen. In Bezug auf den funktionellen Effekt im Tiermodell führte Verwendung von S1FG und AMD3100 zu einer signifikanten Steigerung von Kapillardichte, Kollateralenwachstum und Perfusion gegenüber der Kontrolle. Die Werte lagen dabei im selben Bereich wie durch Verwendung von S1FG und eEPCs erzielte Ergebnisse. Transfektion von S1FG ohne weitere Behandlung führte nicht zu einer signifikanten Änderung eines Parameters zur Kontrolle, während die Verwendung von AMD3100 zu moderaten Steigerungen bei Kapillardichte, und Kollateralenwachstum führte. Die Werte waren jedoch immer noch signifikant geringer als die nach Kombination von S1FG und AMD3100 erreichten Werte. Verwendung einer proteaseresistenten, funktionell jedoch aktiven Mutante für das SDF-1 im S1FG-Molekül führte nicht zu signifikanten Änderungen bei funktionellen Parametern, bis auf eine zwar signifikante, quantitativ jedoch geringe Verringerung des Kollateralwachstums. Zusammenfassend kann man sagen, dass die lokale Applikation eines künstlichen Adhäsionsmoleküls gemeinsam mit einer Mobilisierung knochenmarksständiger endothelialer oder vaskulärer Progenitorzellen zu einem deutlichen funktionellen Effekt führt, der den der Zellmobilisierung ohne Adhäsionssteigerung übertrifft. Dennoch birgt der Ansatz einige Risiken, wie die versehentliche Förderung von Tumorangiogenese oder die Beschleunigung des Wachstums atherosklerotischer Plaques. Zusätzlich bleibt unklar, welche Zellen genau durch das Adhäsionsmolekül rekrutiert werden, und ob es sich überhaupt um eine homogene Zellpopulation handelt. Weiterhin bleibt zu überprüfen, in welcher Weise die Wirksamkeit der Therapie durch chronische Defekte der Progenitorzellmobilisierung und -funktion, wie sie beispielsweise bei Diabetes oder Nikotinabusus auftreten, beeinträchtigt wird, und ob gegebenenfalls Optimierungsmöglichkeiten in Bezug auf das Mobilisierungsregime, den Aufbau des Adhäsionsmoleküls oder die Applikationsart bestehen. Nichtsdestotrotz stellt diese Methode einen vielversprechenden neuen Ansatz zur Verbesserung der bisher eher zwiespältigen Ergebnisse der Zelltherapie dar.

Thu, 29 Mar 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14217/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14217/1/Wuchrer_Alexander.pdf Wuchrer, Alexander

RSA liegt ein multifaktorielles Geschehen zugrunde. Ziel dieser Arbeit war es, unter Fokussierung auf Aspekte innerhalb möglicher Veränderungen des Gerinnungssystems bei Frauen mit RSA durch Beleuchtung eines neuen, möglichen Risikofaktors einen weiteren Erklärungsansatz für RSA zu liefern. In unseren Untersuchungen von RSA-Patientinnen konnten wir keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf zirkulierende MP-Konzentrationen im Vergleich zu Frauen der Kontrollgruppe nachweisen. Lediglich in einer Subgruppe der RSA-Patientinnen zeigten sich erhöhte Konzentrationen von Annexin V+ MP. Das prokoagulatorische Potential dieser MP in Bezug auf die Thrombinbildung in vivo und in vitro zeigte ebenso keine signifikanten Unterschiede innerhalb der Studiengruppen. Entscheidend in diesem Zusammenhang ist, dass sich die Bedeutung von MP nicht allein auf Veränderungen hinsichtlich einer vermehrten Gerinnbarkeit beschränken. Vielmehr scheinen MP auf vielfältige andere Prozessabläufe bezüglich Endothelfunktionen, Angiogenese, Entzündungsprozesse sowie interzellulärem Transport und Austausch Einfluss zu nehmen.

Während der Tumorangiogenese werden neue, tumorspezifische Blutgefäße gebildet. Bei diesem Prozess wird unter anderem der Hauptbestandteil der Basalmembran das Kollagen IV durch die Matrix-Metalloproteasen (MMP) 2 und 9 enzymatisch gespalten. Dabei werden bisher verborgene Bereiche der Kollagen IV α-Stränge freigelegt, welche Endothelzellen als Migrationssignale dienen. Diese als kryptische Bindungsstellen bezeichneten Bereiche sind kennzeichnend für angiogene Blutgefäße. Ziel der Untersuchungen war, ein Oligopeptid zu finden, welches spezifisch an diese Bindungsstellen bindet, das möglicherweise als Konjugat für therapeutisch wirksame Radionuklide und Zytostatika in Frage kommt. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes in vivo/in vitro Phage-Display mit einer M13 Phagenbibliothek durchgeführt und ein Phage isoliert, der an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV bindet und die Oligopeptidsequenz TLTYTWS präsentiert. Im Rahmen einer Phagen-Biodistribution mit LLC Tumor-tragenden Mäusen konnte eine spezifische Anreicherung des Phagen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Der Phage weist also die Fähigkeit auf, sich im Tumorgewebe anzureichern. Diese Eigenschaft wird auch als „Tumor-homing“ bezeichnet. Die von dem Phagen präsentierte Peptidsequenz wurde zur chemische Synthese des TLTYTWS-Oligopeptids verwendet. Dieses Oligopeptid ist in der Lage, in vitro die Bindung des Phagen an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV dosisabhängig zu inhibieren. Weiterhin kann durch Koinjektion des TLTYTWS-Phagen und des TLTYTWS-Oligopeptids bei LLC Tumor-tragenden Mäusen die Akkumulation des Phagen im Tumorgewebe inhibiert werden, was die Spezifität des „Tumor-homings“ belegt. Zudem reduziert das TLTYTWS-Oligopeptid dosis-abhängig die Endothelzell-Differenzierung in vitro im Tube-Formation Assay und die Angiogenese in vivo im Matrigel-Plug Assay. Auf Grund dieser Charakteristika eignet sich das Oligopeptid möglicherweise zum Einsatz in der Diagnostik oder Therapie in der Onkologie.

Metastasen sind die häufigsten bösartigen Hirntumore und gehen mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Die steigende Inzidenz von Hirnmetastasen sowie die limitierten Therapieoptionen unterstreichen die Notwendigkeit der Entwicklung neuer, wirkungsvollerer Ansätze zur Prävention und Therapie dieser gravierenden Erkrankung. Da momentan im Wesentlichen lediglich Endpunktuntersuchungen vorliegen, sind viele Schritte des Metastasierungsprozesses noch wenig verstanden. In der vorliegenden Dissertation wurde daher ein neuartiges Tiermodell etabliert, welches erstmalig das qualitative und quantitative Studium der einzelnen Prozesse der Hirnmetastasierung erlaubte, vom Arrest der Tumorzellen in Blutkapillaren bis hin zum Wachstum einer großen Metastase. Dabei wurden individuelle, fluoreszierende Tumorzellen in Gehirnen lebender Mäuse über einen Zeitraum von Minuten bis Monaten mittels 2-Photonen-Mikroskopie in vivo verfolgt und quantifiziert. Es konnten obligate, ineffiziente und erfolglose Schritte der Hirnmetastasierung bestimmt sowie die Rolle der bestehenden Hirngefäße, Endothelzellen und der Angiogenese ermittelt werden. Die in die Arteria carotis interna injizierten Lungenkarzinom- und Melanomzellen mussten folgende Schritte absolvieren, um über Wochen erfolgreich zu einer Makrometastase zu proliferieren (was nur wenigen Prozent gelang): 1.) vaskulärer Arrest durch Größenrestriktion in Gefäßgabeln, 2.) aktive und frühe Extravasation, 3.) Beibehaltung einer strikt perivaskulären Position über Wochen, 4.) Wachstum entlang bestehender Gefäße (Melanom) oder sehr frühe Angiogenese (Lungenkarzinom). Die Persistenz nicht-proliferierender Tumorzellen über viele Wochen (Ruhezustand, "dormancy") geschah nur im Einzelzellstadium und nur unter Beibehaltung eines strikten Gefäßkontaktes. "Dormancy" war bei Melanomzellen mit hoher Mobilität im Gehirn verbunden, wohingegen Lungenkarzinomzellen statisch blieben. Effiziente und ineffiziente Schritte waren vergleichbar für die Zell-Linien einer Tumorentität, unterschieden sich aber deutlich zwischen den Tumortypen und waren über die gesamte späte metastatische Kaskade verteilt. Chronische VEGF-A-Inhibition durch Bevacizumab induzierte einen Ruhezustand von Lungenkarzinom-Mikrometastasen durch Verhinderung ihres Angiogenese-abhängigen Wachstums zu Makrometastasen. Diese Ergebnisse sprechen für ein Potential antiangiogener Therapien für die Prophylaxe und Therapie der Hirnmetastasierung des Lungenkarzinoms. Das neue Tiermodell erlaubt es somit erstmals, die Wirkung von Therapien und molekularen Faktoren auf jeden einzelnen Schritt der späten metastatischen Kaskade zu bestimmen.

Das Glioblastoma multiforme ist ein maligner hirneigener Tumor mit einer bislang infausten Prognose. Humane mesenchymale Progenitorzellen des Knochenmarks (hMSC) zeigen in-vitro und in-vivo einen ausgeprägten glioblastom¬induzierten Tropismus. Sie sind einfach in der Handhabung, weil sie leicht zu gewinnen, in Kultur zu vervielfältigen und anschließend autolog zu transplantieren sind. Diese Eigenschaften machen hMSC zu vielversprechenden Kandidaten für eine zellbasierte Gentherapie des Glioblastoms. Die molekularen Mechanismen, welche zu der gerichteten Migration der hMSC hin zu den Glioblastomzellen führen und die biologischen Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und Tumorzellen sind bisher kaum verstanden. Um erste Einblicke in diese Wechselwirkungen zu erlangen, wurden im Rahmen des vorliegenden Promotionsvorhabens in-vitro Untersuchungen zu den Grundlagen des glioblastominduzierten Tropismus von hMSC durchgeführt. Die Fragestellung befasste sich insbesondere damit, welche Chemokine an der Vermittlung der glioblastomgerichteten Migration von hMSC beteiligt sind. Hierzu wurden Migrationsversuche mit einer modifizierten Boyden Kammer durchgeführt, wobei zunächst einige bekannte glioblastomassoziierte Chemokin-kandidaten (IL-8, NT-3, TGF-ß1, EGF, CNTF, GDNF, PDGF und BDNF) getestet wurden. Eine signifikante chemotaktische Eigenschaft auf hMSC wurde hierbei für IL-8, TGF-ß1 und NT-3 beobachtet. Die promigratorische Wirkung dieser drei Chemokine erwies sich hierbei als konzentrationsabhängig. Im Weiteren wurde nachgewiesen, dass die bekannte chemotaktische Wirkung von glioblastom-konditioniertem Medium auf hMSC durch die Zugabe von IL-8, TGF-ß, beziehungs¬weise NT-3 neutralisierenden Antikörpern signifikant reduziert wird. Somit konnte funktionell nachgewiesen werden, dass diese Chemokine tatsächlich eine Rolle beim glioblastominduziertem Tropismus der hMSC spielen. Ergänzend wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung die Expression der entsprechenden Chemokin¬rezeptoren auf den hMSC nachgewiesen und die Sekretion der Chemokine durch die Glioblastomzellen mittels ELISA quantifiziert. Aus Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe ist bekannt, dass auch VEGF-A eine chemotaktische Wirkung auf hMSC besitzt. Wie VEGF-A werden auch IL-8, TGF-ß1 und NT-3 von Glioblastomen überexprimiert. Zudem wird über diese Chemokine die Neoangiogenese jener Tumore vermittelt. Dies führt zu der Hypo-these, dass Glioblastome die Migration der hMSC aus dem peripheren Blut in das Tumorgebiet über angiogenetische Signalwege vermitteln. Damit könnten hMSC an dem Prozess der Angiogenese des Glioblastoms beteiligt sein. Ein genaues Verständnis des möglichen Beitrages von hMSC zum Glioblastomwachstum ist eine unabdingbare Voraussetzung für ihre mögliche klinische Anwendung als gentherapeutische Vektoren beim Menschen. Deshalb müssen zukünftig neben weiteren in-vitro vor allem in-vivo Studien mit Langzeit-beobachtungen im Tiermodell durchgeführt werden. In diesen Studien sollten die Auswirkungen einer Transplantation nativer hMSC einerseits und genetisch modifizierter therapeutischer hMSC andererseits auf das Glioblastomwachstum untersucht werden. Die vielversprechenden Ergebnisse der bisher vorliegenden Arbeiten lassen hoffen, dass in nicht allzu ferner Zukunft eine bessere Therapie für Patienten mit Glioblastom gefunden werden kann.

Das Glioblastoma multiforme (GBM, WHO-Grad IV) ist ein äußerst aggressiver und stark vaskularisierter Tumor. Trotz multimodaler Therapiekonzepte mit chirurgischer Resektion, Bestrahlung und Chemotherapie haben die betroffenen Patienten eine schlechte Prognose von lediglich 9 bis 15 Monaten Überlebenszeit nach Diagnosestellung. Innovative Therapiekonzepte sind daher dringend erforderlich. Im Fokus dieser Arbeit stand das abnorme Gefäßsystem maligner Hirntumoren. Aufbauend auf einem besseren Verständnis der Gefäßbiologie dieser Tumoren wurden potenzielle Strategien für Diagnostik und Therapie entwickelt und evaluiert. Progenitorzellen aus dem Knochenmark sind in vielfacher Weise an der Neoangiogenese von Tumorgefäßen beteiligt. Immundefizienten Ratten wurden in dieser Arbeit primäre humane MSC systemisch appliziert, nachdem den Tieren zuvor ein humanes Gliom implantiert worden war. Die Rekrutierung der MSC in den Tumor wurde immunhistochemisch nachgewiesen. Die endotheliale Differenzierung der MSC konnte mit gentechnisch modifizierten MSC-Linien bestätigt werden. Diese Zellen enthielten einen Vektor mit dem Reportergen RFP (red fluorescent protein), dessen Expression unter der Kontrolle des endothelspezifischen Tie2-Promotor/Enhancer-Konstruktes steht. Darauf aufbauend wurde eine MSC-Linie etabliert, bei der statt des Reportergens RFP das Selbstmordgen HSV-TK unter der Kontrolle des Tie2-Promoters steht. Die Hypothese hierzu ist, dass nach systemischer Verabreichung dieser MSC durch Zugabe von Ganciclovir eine selektive Toxizität auf den Tumor bewirkt wird. Zur genaueren Charakterisierung der Gefäßstrukturen in Hirntumoren wurde die Expression Lymphgefäß-assoziierter Moleküle in Gewebe unterschiedlicher Gliome untersucht. Die lymphangiogenen Wachstumsfaktoren VEGF-C,-D und ihr Rezeptor VEGFR-3 zeigten im GBM hohe Expressionswerte. Die Expression von VEGFR-3 unterschied sich signifikant von der in niedriggradigen Astrozytomen (WHO-Grad II). Podoplanin war in allen Gewebeproben des GBM sehr hoch exprimiert, in einigen Zellen zeigte sich eine Co-Lokalisation mit Prox-1. Die Expression war allerdings nicht gefäßassoziiert, sondern ausschließlich auf den Tumorzellen zu finden. Eine streng endotheliale Lokalisation zeigte sich dagegen im anaplastischen Oligodendrogliom (WHO-Grad III), in dem Podoplanin mit VEGFR-3 co-exprimiert ist. Durchgehend negativ für Podoplanin waren alle untersuchten Astrozytome (WHO-Grad II). Für weiterführende Untersuchungen zur Funktion von Podoplanin wurden zwei GBM-Zelllinien etabliert, die einen Podoplanin-Überexpressionsvektor stabil exprimieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die zentrale Bedeutung des Gefäßsystems für das GBM. Es wurde gezeigt, dass MSC effektiv aus der Peripherie in den Hirntumor rekrutiert werden und dort aktiv an der Angiogenese beteiligt sind. MSC eignen sich somit, nach genetischer Modifikation, als Vehikel für therapeutisch wirksame Gene, mit denen das neu entstehende Gefäßsystem des GBM gezielt angegriffen werden kann. Für die entsprechenden in vivo-Versuche wurde bereits eine gentechnisch modifizierte MSC-Linie entwickelt und ein Therapieschema entworfen. Obwohl das Gehirn unter normalen Bedingungen kein Lymphgefäßsystem besitzt, wurden im Gewebe der malignen Hirntumoren in dieser Arbeit auch Lymphgefäß-assoziierte Moleküle nachgewiesen. Die Expression des Rezeptor-Liganden-Systems VEGFR-3/ VEGF-C,-D korreliert dabei mit dem Malignitätsgrad der Hirntumoren. Das gegensätzliche Expressionsmuster von Podoplanin könnte ein diagnostisches Kriterium darstellen, um Hirntumore mit unterschiedlichem Malignitätsgrad histopathologisch voneinander zu unterscheiden oder es könnte eine potenzielle Zielstruktur für neue Therapieansätze darstellen. Mit den etablierten GBM-Zelllinien steht ein Zellmodell zur weiteren Analyse der noch ungeklärten Funktion des Podoplanins im GBM zur Verfügung.

Cathepsine sind lysosomale Cysteinproteasen, die neben der allgemeinen Proteindegradation in Lysosomen auch spezifische Funktionen ausüben, die eine limitierte Proteolyse erfordern. Zudem werden Cathepsine sezerniert, weshalb man sie auch im Extrazellulärraum findet, wo sie ebenfalls an verschiedenen biologischen Vorgängen, wie etwa der Zellmigration/Invasion, teilnehmen. Über Cathepsin X, einen relativ neu entdeckten Vertreter dieser Proteinklasse, war zu Beginn der Promotionsarbeit noch wenig bekannt. Die Struktur und das Aktivitätsprofil konnten zwar bereits gelöst werden, über mögliche (patho-)physiologische Funktionen gab es jedoch noch keine Erkenntnisse. Das Hauptziel meiner Untersuchungen war daher, mittels geeigneter Methoden nähere Aufschlüsse über die Rolle von Cathepsin X oder seiner Proform innerhalb und außerhalb der Zelle zu erlangen. Dies sollte vorwiegend durch die Analyse der Expression und Sekretion dieser Protease, sowie durch das Auffinden von Interaktionspartnern erfolgen. Wie sich in Vorversuchen zeigte, wird Cathepsin X in humanen Leukozyten unterschiedlich stark exprimiert. Da eine hohe Expression insbesondere in Monozyten vorlag, wurde für weitere Analysen das Zellmodell THP-1 eingesetzt, das auch für die Differenzierung zu Makrophagen-ähnlichen Zellen durch Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) oder all-trans Retinsäure (ATRA) verwendet werden kann. Interessanterweise zeigten diese Agenzien unterschiedliche Auswirkungen auf die Expression und Sekretion von Cathepsin X. So wurde mit PMA eine starke intra- und extrazelluläre Erhöhung der Protease verzeichnet, während mit ATRA das Gegenteil der Fall war. Da eine differenzielle Expression von Cathepsin X in Leukozyten auf eine mögliche Funktion in der Entzündungsantwort hindeutet, schien eine Untersuchung der Wirkung von proinflammatorischen Zytokinen und extrazellulären Matrix (EZM)-Proteinen sinnvoll, weil diese Faktoren ebenfalls die Sekretion von Proteasen beeinflussen können. Die untersuchten Zytokine hatten allerdings keinen Effekt auf die Sekretion von Cathepsin X aus THP-1-Zellen, wohingegen mit dem EZM-Protein Vitronektin eine Verdopplung der Cathepsin-X-Konzentration im Medium beobachtet wurde. In diesem Kontext konnte nachgewiesen werden, dass Vitronektin durch die Interaktion mit dem Zelloberflächenrezeptor Integrin avb3 den Sekretionsapparat der Zelle beeinflusst, wobei offensichtlich das Sequenzmotiv Arginin-Glyzin-Aspartat (RGD), welches in Vitronektin enthalten ist, für diesen Vorgang entscheidend ist. Neben Cathepsin X wurde auch für die Cathepsine B und L eine erhöhte Freisetzung nach Inkubation mit Vitronektin gemessen, was zeigt, dass dieser durch das EZM-Protein ausgelöste Mechanismus nicht auf Cathepsin X beschränkt ist. Umgekehrt ließ sich in einem weiteren Zellmodell (HUVEC) durch den Einsatz von „small-interfering RNA“ (siRNA) die Expression von Cathepsin X erniedrigen, was zu einer verminderten Migration der HUVEC in einem Invasionsversuch führte. Dies deutet auf eine Funktion von Cathepsin X in der Zellmotilität hin. Weil Cathepsin X, ähnlich wie Vitronektin, ein exponiertes RGD-Motiv in seiner Proregion aufweist, sollte nun eine mögliche Interaktion mit Integrinen untersucht werden. Tatsächlich ließ sich eine RGD-abhängige Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 zeigen. Somit werden in dieser Arbeit zwei wesentliche neue Aspekte in der Regulation der Sekretion und seiner Beteiligung an Migrationsvorgängen gezeigt, wobei die Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 eine besondere Rolle zu spielen scheint. Ob diese beiden Vorgänge miteinander gekoppelt sind, konnte mit den bisherigen Ergebnissen noch nicht bewiesen werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse jedoch darauf hin, dass extrazelluläres (Pro)Cathepsin X neben seiner Rolle als Protease auch nicht-proteolytische Funktionen, beispielsweise als Ligand bestimmter Zelloberflächenstrukturen ausüben kann. Dieser Aspekt könnte im Hinblick auf eine therapeutische Inhibition von Angiogenese und Metastasierung von Tumorzellen durch Antikörper gegen Cathepsin X und/oder Integrine von großem Nutzen sein.

Der Hauptregulator der vaskulären Homöostase ist das Endothel, welches eine Vielzahl an vasoprotektiven Effekten ausübt. Die Integrität und Regulation des endothelialen Zellayers der Blutgefäße ist von großer Bedeutung bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die Basis dieser Phänomene ist in der dynamischen und exakt kontrollierten Regulation des Zytoskeletts begründet. Die wichtigsten Regulatoren des Zytoskeletts stellen die GTPasen der Rho-Familie und deren Effektoren dar. Im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten wir in primären humanen Nabelschnurendothelzellen, eine neu in Erscheinung tretende Zytoskelettstruktur, der wir in Anlehnung an ähnliche Proteingruppierungen in monozytären Zellen den Namen HUVEC-Podosomen gaben. HUVEC-Podosomen sind aufgrund ihrer Komponenten mit klassischen Podosomen vergleichbar. Allerdings gibt es zwischen beiden Strukturen auch Unterschiede, denn während klassische Podosomen aus Ring und Kern bestehen, zeigen HUVEC-Podosomen eine zweischichtige Architektur. Wie wir weiterhin nachweisen konnten liegen Podosomen der Endothelzellen an der ventralen Plasmamembran und haben engen Kontakt mit der extrazellulären Matrix.. Somit fungieren sie, wie auch die klassischen Podosomen, als Adhäsionsstrukturen. Sie dienen aber nicht nur der Adhäsion, denn wie bei FITC-markierten Monolayer-Versuchen gezeigt werden konnte, haben sie auch eine proteolytische Aktivität, die insbesondere beim Matrixverdau und der daran anschließenden Migration von Bedeutung ist. Ferner können wir zeigen, daß HUVEC-Podosomen in ruhenden, konfluenten Zellayern nicht beobachtet werden können. Sie lassen sich aber in migratorischen (subkonfluent oder nach Verwundung) HUVEC, in hoher Anzahl und diversen ringförmigen Formationen, vorwiegend in Bereichen nahe dem Leitsaum nachweisen. Wie wir mit Hilfe von live cell imaging-Experimenten zeigen konnten, sind diese Strukturen hochdynamisch und breiten sich wellenartig mit einem weiten Radius innerhalb einer Zelle aus. Scheinbar dispergieren diese Formationen oder fusionieren mit der Zellplasma, wodurch sie die enthaltenen Proteine für viele andere zytoplasmatische oder membranöse Prozesse freigeben könnten. Durch Experimente, in denen Zytokine wie VEGF, bzw. Zytokin-produzierende Zellen wie Monozyten den HUVEC-Kulturen zugegeben wurden, konnten wir zeigen, daß diese die Bildung von Podosomen induzieren und sogar erheblich steigern. Unsere Arbeiten mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GTPase-Mutanten zeigten weiterhin, daß diese bei der Organisation und Entstehung der HUVEC-Podosomen von entscheidender Bedeutung sind. Ferner konnte mit Hilfe von Mikroinjektionsversuchen von einer Teildomäne (A) des N-WASP-Proteins verifiziert werden, daß der Mechanismus zur Bildung der HUVEC-Podosomen eine Arp2/3-abhängige Aktinnukleation beinhaltet. Weiterhin ist die Bildung dieser Adhäsionsstrukturen auch von Src Tyrosinkinasen und PI3-Kinase abhängig. Eine der Komponenten von HUVEC-Podosomen ist das Markerprotein Drebrin. Drebrin kann nur in diesen Strukturen und an Zell-Zell-Kontakten in HUVEC detektiert werden. Mikroinjektionsversuche von diversen Konstrukten der unterschiedlichen Regionen von Drebrin zeigen, daß dieses Protein von großer Bedeutung für die Bildung und Struktur der HUVEC-Podosomen ist. Die einzelnen Protein-Protein-Interaktionen von podosomalen Komponenten untereinander und mit Drebrin wurden mit Hilfe von Immunpräzipitation getestet. Es ist uns jedoch nicht gelungen einen Drebrin-Interaktionspartner zu finden. Eine Interaktion von Drebrin konnten wir nur mit Drebrin selbst in Form einer Dimerisierung bzw. mit F-Aktin nachgeweisen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß es sich bei HUVEC-Podosomen um ein multifunktionelles Organell handelt. Wie wir in dieser Arbeit darstellen, sind HUVEC-Podosomen Adhäsionsstrukturen. Sie können am häufigsten am Leitsaum detektiert werden, wobei ihre Generierung nur in Zellen mit migratorischen Phänotyp (in Zellen am Wundrand oder in subkonfluenten layern) detektiert werden kann. Beide Tatsachen sprechen dafür, daß HUVEC-Podosomen den Prozeß der Migration unterstützen. Zudem können diese Adhäsionsstrukturen die Matrix degradieren, wodurch sie so wiederum zur Migration aber auch invasiven Prozessen beitragen könnten. HUVEC-Podosomen könnten auch eine Funktion als Speicherform ihrer Komponenten ausüben. Sie fusionieren mit der Zellmembran und liefern so möglicherweise notwendige Proteine und Signale, die die Induktion von Protrusionen ermöglichen und so migratorische Prozesse unterstützen könnten. Durch die Involvierung u. a. von Drebrin, das an Zell-Grenzen detektiert werden kann, können HUVEC-Podosomen möglicherweise einen Einfluß auf Zell-Zell-Kontakte und Vorgänge wie Angiogenese ausüben. Dies bestätigt auch die Tatsache, daß Zytokine die Anzahl an Zellen erhöhen, die HUVEC-Podosomen generieren können und Vorgänge wie Wundheilung beschleunigt ablaufen lassen und so u. U. eine klinische Relevanz haben könnten.

Unter den Prognosefaktoren beim kolorektalen Karzinom hat das Tumorstaging den größten Stellenwert und dient der weiteren Therapieplanung. In den letzten Jahren wurden zunehmend auch Tumormarker hinsichtlich der prognostischen Aussagekraft untersucht, es existieren aber kaum Studien, die an großer Fallzahl mehrere Tumormarker im Vergleich zu den etablierten Prognosefaktoren multivariat evaluiert haben. In der vorliegenden Arbeit wurden die Tumormarker CEA, CA 19-9, CA 242, CA 72-4, CYFRA 21-1, hCGß, S100 und HGF hinsichtlich ihrer prognostischen Wertigkeit beim kolorektalen Karzinom analysiert. Die präoperativen Tumormarkerwerte von CEA und CA 19-9 lagen bei 1089 Patienten (Kollektiv I) vor. Bei einem Teil dieser Patienten (n=450) waren Restproben vorhanden, so dass retrospektiv zusätzlich die Tumormarker CA 242, CA 72-4, CYFRA 21-1, hCGß, S100 und HGF analysiert werden konnten (Kollektiv II). Es zeigte sich bei allen Tumormarkern eine höhere Freisetzung mit zunehmender Tumorinfiltrationstiefe. Bei CEA und CA 19-9 wurde außerdem ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Serumkonzentration und dem Lymphknotenstatus festgestellt. Bezüglich der Korrelation der Tumormarker untereinander wurde der höchste Koeffizient für CA 19-9 und CA 242 errechnet (rs=0.79). Basierend auf den aktuellen Empfehlungen für adjuvante Therapien beim kolorektalen Karzinom wurde eine Unterteilung in Prognosegruppen vorgenommen: In der günstigen Prognosegruppe (GPG) befanden sich Patienten mit einem Kolonkarzinom Stadium I-II oder Rektumkarzinom Stadium I, in der ungünstigen Prognosegruppe (UPG) befanden sich Patienten mit einem Kolonkarzinom Stadium III oder einem Rektumkarzinom Stadium II oder III. In Anlehnung an eine Studie von Harrison et al wurden zusätzlich alle Patienten mit einem Kolonkarzinom ohne Lymphknotenbefall gesondert betrachtet. Ziel unserer Studie war es zu untersuchen, ob durch Berücksichtigung von Tumormarkern innerhalb der Prognosegruppen eine detailliertere prognostische Einschätzung mit entsprechender therapeutischer Konsequenz erfolgen kann. Dabei war unser primäres Zielkriterium das rezidivfreie Intervall, zusätzlich untersuchten wir das tumorbedingte Gesamtüberleben. 161 In der statistischen Auswertung wurde zunächst überprüft, ob eine lineare Abhängigkeit zwischen der Serumkonzentration der Tumormarker und dem Rezidivrisiko besteht. Eine solche Linearität konnte nur für CEA gezeigt werden, es ging daher in logarithmierter Form in die multivariate Analyse ein. Bei den übrigen Tumormarkern musste ein Cut-Off gesucht werden, wobei in der vorliegenden Arbeit weder die herstellerüblichen Cut-Off-Werte verwendet wurden, noch nach dem für das Kollektiv optimalen Cut-Off gesucht wurde. Vielmehr wurde versucht, mittels Bootstrapverfahren reproduzierbare Cut-Offs zu ermitteln. Nach unseren Ergebnissen ist CEA zu Recht als Kategorie I Prognosemarker klassifiziert worden. Dies konnte an großer Fallzahl und unter Berücksichtigung verschiedener anderer Tumormarker bestätigt werden. Auch in der Gruppe der Patienten mit einer günstigen Prognose sowie der N0-Kolontumoren erwies sich CEA als unabhängiger Prognosefaktor. Die Patienten dieser Gruppen erhalten laut dem aktuellen Konsensus keine adjuvante Therapie. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit sollte CEA jedoch in den Leitlinien der American Society of Clinical Oncology als prognostisch relevanter Parameter berücksichtigt werden und auch in die Therapieplanung mit eingehen. In der multivariaten Analyse hat sich darüber hinaus beim Kollektiv I gezeigt, dass neben CEA auch CA 19-9 ein stadienunabhängiger Prognosefaktor ist, jedoch nur für die ungünstige Prognosegruppe. Innerhalb des Kollektivs II erreichten die Tumormarker CEA, CA 19-9, CA 242, CA 72-4, S100 und HGF Signifikanz. Die beiden neuen und wenig erforschten Tumormarker S100 und HGF waren starke unabhängige Prädiktoren in der günstigen Prognosegruppe dieser Auswertung, sogar stärker als CEA. Dieses Ergebnis muss durch prospektive große Studien bestätigt werden. Im Gegensatz zu S100 erreichte HGF auch in der ungünstigen Prognosegruppe Signifikanz, war aber bezüglich der prognostischen Aussagekraft dem CA 242 bzw. CA 19-9 unterlegen. Gerade im Rahmen kommender Therapiestudien, bei denen der Einfluss neuer Medikamente auf die Angiogenese untersucht wird, könnte HGF von grossem Interesse sein. Der Tumormarker CA 242 kann als äquivalenter Marker zum CA 19-9 gesehen werden, so dass die parallele Bestimmung beider Tumormarker primär nicht sinnvoll ist. CA 72-4 erreichte in der uni- und multivariaten Analyse nur für das Überleben innerhalb der ungünstigen Prognosegruppe Signifikanz. 162 Die beiden Tumormarker hCGß und CYFRA 21-1 zeigten in dieser Arbeit keinerlei prognostische Bedeutung. Um unsere Ergebnisse für die klinische Anwendung zusammenzufassen, wurde für alle prognostisch relevanten Faktoren ein Prognoseindex entwickelt und zwar zunächst anhand des großen Kollektivs I. In der günstigen Prognosegruppe beinhaltet dieser Score derzeit lediglich T und logCEA, in der ungünstigen Prognosegruppe T, N, Lokalisation des Primärtumors, logCEA und CA 19-9 (Cut-off 55 U/ml). Eine Einteilung der Patienten bezüglich dieser Prognose-Scores zeigt eine deutliche Überlappung der ursprünglichen Prognosegruppen im Bezug auf das rezidivfreie Intervall. Daraus geht eindeutig hervor, dass die Bestimmung und Bewertung beider Tumormarker, also von CEA und von CA 19-9, sinnvoll ist und eine sehr viel genauere Prognoseabschätzung ermöglicht.

In dieser Arbeit soll eine Dysregulation der an der Angiogenese beteiligten TGF-Beta-Isoformen und ihrer Rezeptoren in Hypophysentumorzellen als möglichen pathogenetischen Faktor in der Tumorentstehung bzw. -progression von Hypophysenadenomen dargestellt werden.

Tumorendothelmarker (TEM) 5 gehört zu den Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und wird in Endothelzellen während der physiologischen Angiogenese und Tumorangiogenese exprimiert. Bisher wurden noch kein Ligand und keine Funktion von TEM5 beschrieben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass TEM5 in Endothelzellen während der In Vitro-Angiogenese intrazellulär an einer konservierten Proteolysestelle (GPS) gespalten wird. Diese Proteolyse führte einerseits zur Translokation der nicht-kovalent verbunden TEM5-Fragmente an die Zelloberfläche und andererseits zur Freisetzung von löslichem TEM5 (sTEM5). Bindungsstudien haben ergeben, dass sTEM5 mit verschiedenen Glykosaminoglykanen interagiert. Sequenzanalysen und funktionelle und biochemische Studien haben gezeigt, dass sTEM5 eine kryptische RGD-Bindungsstelle für Integrin alpha(v)beta(3) enthält. Matrixmetalloprotease 9-prozessiertes, jedoch nicht unprozessiertes, sTEM5 vermittelte Endothelzelladhäsion durch direkte Interaktion mit Integrin alpha(v)beta(3). Die Interaktion von immobilisiertem proteolytisch prozessierten sTEM5 mit Integrin alpha(v)beta(3) vermittelte Überleben von Wachstumsfaktor-deprivierten Endothelzellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu der Schlußfolgerung, dass sTEM5 während der Angiogenese von Endothelzellen freigesetzt wird und an Glykosaminoglykane in der extrazellulären Matrix und auf der Oberfläche von Zellen bindet. Proteolytische Prozessierung von sTEM5 führt zur Freilegung seines RGD-Motivs und vermittelt Überleben von Endothelzellen durch die Interaktion mit Integrin alpha(v)beta(3).

Die Regulation der endometrialen Zytokinexpression steht im Zentrum der aktellen Forschungen zum Phänomen rezidivierender Frühaborte. Ziel der Arbeit war es die Auswirkungen der endometrialen Regulationsmechanismen Hormonstimulation, Hormonentzug, Zytokinstimulation und Hypoxie auf die mRNA Expression dreier verschiedender, für die Implantation der Blastozyste bedeutsamer Zytokine, am Kulturmodell endometrialer Zellen zu untersuchen, wobei eine getrennte Kultivierung von epithelialen und stromalen Zellen erfolgte. VEGF hat eine wichtige Funktion bei der Regulation der Angiogenese und wird im humanen Endometrium v.a. von Epithelzellen exprimiert. IL-1ß beeinflußt maßgeblich die Rezeptivität des Endometriums und spielt eine wichtige Rolle beim embryo-maternalen Dialog. G-CSF ist wichtig für die utero-plazentare Kommunikation und die Dezidualisierung der Stromazellen. Die ungestörte endometriale Differenzierung ist Basis einer normalen Rezeptivität. Diese wird durch Steroidhormone gesteuert, weshalb wir in dieser Arbeit die Auswirkungen der Steroidhormone 17-ß-Östradiol und Progesteron auf die Expression der genannten Zytokine untersuchten. Entgegen der Ergebnisse vorausgehender Studien konnte hierbei kein Effekt der Steroide auf die Zytokinexpression festgestellt werden. Des Weiteren stellte sich uns die Frage einer unmittelbaren Beeinflussung durch andere autokrine oder parakrine Faktoren wie z.B. Zytokine. Die Stimulation der Zellen mit IL-1ß und IL-6 führte bei den Stromazellen zu einem signifikanten Anstieg der mRNA-Expression von IL-1ß und G-CSF. Schließlich untersuchten wir den Einfluß von Hypoxie, welche bereits in vielen vorausgehenden Studien als entscheidender Regulationsfaktor für eine gesteigerte endometriale VEGF Expression beschrieben wurde. Dies konnte durch unsere Untersuchungen bestätigt werden, was gleichzeitig als Beweis der Funktionsfähigkeit unserer Kulturmodelle bei hypoxischen Bedingungen diente. Darüberhinaus konnte durch Hypoxie auch für die Zytokine Il-1ß und G-CSF ein signifikanter Expressionsanstieg verzeichnet werden.

Maligne Tumorzellen besitzen die Fähigkeit, sich vom Primärtumor zu lösen und Metastasen zu bilden. Ein Verlust oder Mutationen im Kalzium-abhängigen, homophilen Zell-Adhäsionsmolekül E-Cadherin korrelieren häufig mit der Metastasierung epithelialer Tumore. Vorarbeiten haben gezeigt, dass in humanen E-Cadherin negativen MDA-MB-435S Zellen die Transfektion von bestimmten mutierten E-Cadherin Genen zu einer reduzierten Adhäsion, erhöhten Motilität und veränderten Zellmorphologie führt. Basierend auf diesen Vorarbeiten war das Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, welchen Einfluß mutierte E-Cadherine und der Zellkontakt auf das Genexpressionsprofil haben. Das Genexpressionsprofil wurde mittels eines im Rahmen dieser Arbeit etablierten 1259 Sonden (~899 Gene) umfassenden cDNA Mikroarrays bestimmt. Es konnten 88 Prozent der mittels des cDNA Mikroarrays gefundenen Genexpressionsunterschiede durch die Validierung mit Northern Blot Analyse und 94 Prozent durch quantitative realtime RT PCR im Bezug auf die Richtung der Genexpressionsveränderung bestätigt werden. Mit Hilfe des cDNA Mikroarrays wurde der Einfluß von E-Cadherin auf den WNT-Signalweg untersucht. Die in dieser Arbeit durchgeführten Gen- und Proteinexpressionsuntersuchungen zeigten, dass der E-Cadherin Status die Expression der im WNT-Signalweg involvierten Gene DKK1, SFRP1, SFRP3, CTNNAL1 und FZD7 so beeinflusst, dass die beta-Catenin Menge in der Zelle stabil gehalten wird. Diese Ergebnisse wurden bereits in Laboratory Investigation (Laux et al., 2004) publiziert. Die Zelllinien, die aufgrund von E-Cadherin Mutationen den Zell-zu-Zellkontakt verloren haben, zeigten eine differentielle Expression von Genen, die in der Angiogenese, Proliferation, Matrix Degradierung und Motilität involviert sind. Viele dieser Gene spielen in der Metastasierung als auch in der Wundheilung eine wichtige Rolle. Die Zelllinie mit WT E-Cadherin Status hat einen engen Zell-zu-Zellkontakt und zeigte eine erhöhte Expression von E-Cadherin Repressoren im Vergleich zu den E-Cadherin negativen oder mutierten Zelllinien. Bei einer hohen Zelldichte konnte ebenfalls eine erhöhte Genexpression der E-Cadherin Repressoren detektiert werden. Die Zelllinien erkennen sensitiv den Zell-zu-Zellkontakt Status und regulieren daraufhin autokrin den E-Cadherin Status über eine veränderte Expression der E-Cadherin Repressoren. Eine Regulation des E-Cadherin Status war bei den hier verwendeten Zelllinien aber aufgrund eines artfremden beta-Aktin Promotors vor den E-Cadherin Konstrukten nicht möglich. Um festzustellen, inwieweit der Zell-zu-Zellkontakt für die E-Cadherin abhängige differentielle Expressionen verantwortlich ist, wurde dessen Einfluß auf das Genexpressionsprofil mittels Zelldichteversuche untersucht. Bei einer geringen Zelldichte, bei der die Zellen wenig Kontakt zueinander haben, korrelieren die Genexpressionsver-änderungen mit denen der Zelllinien, die aufgrund von E-Cadherin Mutationen keinen Zell-zu-Zellkontakt haben. Die vorliegende Arbeit hat zur Identifikation von Genen, welche eine wichtige Rolle in der durch mutiertes E-Cadherin vermittelten Invasion spielen (z.B. MMP1, MMP3, VEGFC, SPARC, ITGA3, CYR61, TIMP3, PRKCD, MXI1, PRLR, PLAUR und LASP1), beigetragen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass der Zellkontakt maßgeblich an der differentiellen Expression deren Gene beteiligt ist. Weiterführende Studien können nun die gefundenen Kandidatengene bezüglich Diagnose und Therapie von malignen Tumoren mit E-Cadherin Mutationen genauer charakterisieren. Die Inhibition einiger dieser Proteine stellt einen viel versprechenden Therapieansatz zur Behandlung dieser Tumoren dar.

Wed, 14 Jun 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5395/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5395/1/Schruefer_Ruth.pdf Schruefer, Ruth ddc:570, ddc:500, Fakult

Das Blutgefäßsystem eines Organismus stellt eines der größten Organe des menschlichen Körpers dar. Den Grundbaustein der Gefäße bilden Endothelzellen, die durch eine einfache Zellschicht das gesamte System von innen auskleiden. Bei einer Vielzahl an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, wie beispielsweise dem weiblichen Menstruationszyk¬lus, der Wundheilung, den Entzündungsreaktionen oder aber der Ischämie und der Tumorpro¬gression, spielt das Endothel eine wesentliche Rolle. Die Aktivierung der Endothelzellen wird durch zahlreiche verschiedene Faktoren reguliert, die entweder im Blut zirkulieren, von be¬nachbarten Zellen oder aber auch von Tumorzellen sezerniert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Hochdurchsatz-Screen etabliert, bei dem sich Gene mit einem pro-angiogenen Effekt identifizieren lassen. Hierzu erfolgte die individuelle Transfektion und Expression von 34.596 verschiedenen cDNAs in HEK 293-Zellen. Zur Testung wurden deren konditionierte Medienüberstände auf primäre Endothelzellen (HUVECs) transferiert. Zwei bereits aus der Literatur bekannte pro-angiogene Faktoren, bFGF und VEGF, wurden zur Protokoll-Etablierung als Positivkontrollen eingesetzt. Im Screen konnten insgesamt 13 cDNAs identifiziert werden, die einen pro-angiogenen Ef¬fekt zeigten. Unter ihnen fanden sich auch die zwei Positivkontrollen wieder, was einen direkten Beleg für die Funktionalität des Screens darstellt. Des Weiteren wurden vier bekannte und fünf unbekannte cDNAs identifiziert, bei denen bisher noch kein Zusammenhang mit Angiogenese gezeigt werden konnte. Die vier bekannten Gene kodieren für zytosolisch lokali¬sierte Proteine, deren Expression in verschiedene Säuger-Zellen zur Produktion und Sekretion pro-angiogener Faktoren führt. Im Anschluss an den Screen wurde eines der unbekannten Gene (NM_020746) detaillierter charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein 56,6 kDa großes Protein, das aufgrund erster Funk¬tionshinweise den Namen hSEP (human Stimulator of Endothelial Proliferation) erhielt. Die Expression von hSEP in HEK 293-, sowie in anderen Säuger-Zellen, generierte konditionierte Überstände, welche in Mangelmedium gehaltene Endothelzellen, nicht aber Fibroblasten zum Wachstum stimulieren. Mit Hilfe biochemischer Analysen wurde die Sekretion von hSEP nach der Expression in HEK 293-Zellen nachgewiesen. Besondere Bedeutung bei der Lokali¬sierung des Proteins kam hierbei einer bioinformatisch vorhergesagten C-terminalen Trans¬membrandomäne zu. Die Deletion dieser Domäne erzeugte ein deutlich effektiver sezerniertes Protein-Fragment (SEP1-510), führte allerdings gleichzeitig zu einem signifikanten Rückgang der Wachstums-Stimulation bei HUVECs. Des Weiteren ging die für hSEP nachgewiesene Lokalisierung im Golgi und ER zu Gunsten einer diffusen intrazellulären Verteilung verloren. Um den Wirkungsmechanismus von hSEP aufzuklären, wurden verschiedene Experimente durchgeführt. Expressionsanalysen von HEK 293-Zellen, die hSEP exprimierten, zeigten die Induktion verschiedener pro-angiogener Gene wie beispielsweise IL-8, RANTES und VEGF. Des Weiteren korrelierte die Anwesenheit von hSEP im Überstand nicht reproduzierbar mit der Stimulation von HUVECs. Außerdem gelang es nicht, aktives hSEP-Protein rekombinant zu erzeugen, welches für einen direkten Beweis seiner Funktionalität erforderlich gewesen wäre. Darüber hinaus wurden Hinweise auf eine Ko-Expression von hSEP mit VEGF unter hypoxischen Bedingungen sowie in verschiedenen soliden Tumoren gefunden. In welchen Zusammenhang die Expression dieser beiden Proteine steht, müssen weitere detaillierte Un¬tersuchungen zeigen. Insgesamt ist es denkbar, dass hierdurch neue mögliche therapeutische Ansätze für eine Inhi¬bition bei der Tumorangiogenese eröffnet werden könnten.

Der basic fibroblast growth factor (bFGF) und der vascular endothelial growth factor (VEGF) sind Wachstumsfaktoren der Familie der Zytokine, die eine wichtige Rolle in der Angiogenese sowohl in physiologischen, als auch in pathologischen Prozessen spielen. Bei der Entstehung von kindlichen Hämangiomen wird den beiden Wachstumsfaktoren aufgrund ihrer starken angiogenetischen Potenz ein hoher Stellenwert zugesprochen. In dieser Arbeit wurden die Plasmakonzentrationen von bFGF und VEGF und die Konzentrationen von bFGF im Urin bei Patienten mit Hämangiomen gemessen. Es wurde untersucht, ob die Konzentrationen beider Faktoren erhöht sind und ob erhöhte Spiegel mit den klinischen Parametern korrelieren. Unter Verwendung des enzyme linked immunosorbent assay wurden die Konzentrationen von VEGF und bFGF im EDTA-Plasma bei gesunden Säuglingen und Kleinkindern (Kontrollgruppe) und bei Säuglingen und Kleinkindern mit Hämangiomen (Patientengruppe) gemessen. Zudem wurde die bFGF Konzentration im Urin bestimmt. Klinische Merkmale wie Größe und Beschaffenheit der Hämangiome wurden dokumentiert. Erhöhte Werte von bFGF und VEGF im Plasma wurden bei Patienten mit grossen Hämangiomen (> 5cm) und hoher Wachstumstendenz gefunden. Die gemessenen Werte von bFGF im Urin waren im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht signifikant erhöht. Bei einer Patientin mit diffuser neonataler Hämangiomatose lagen die Konzentrationen beider Faktoren signifikant höher als bei der Kontrollgruppe. Unter der anti-angiogenetischen Therapie mit Interferon-α2a kam es zu einem starken Abfall der zu Beginn der Behandlung hohen VEGF Plasmaspiegel. Die Behandlung zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf die hohen bFGF Konzentration im Plasma und Urin. Diese Arbeit zeigt, dass insbesondere bei Patienten mit großen und proliferierenden Hämangiomen erhöhte Konzentrationen der Angiogenesefaktoren VEGF und bFGF im Plasma und Urin gemessen werden können. Aufgrund der inter- sowie intraindividuellen Schwankungen der Plasmaspiegel beider Faktoren ist allerdings der klinische Nutzen zur Verlaufsbeurteilung eingeschränkt. Dennoch mag gerade bei den systemischen Formen, den Hämangiomatosen, in Zukunft die Messung von Angiogenesefaktoren für die Therapiekontrolle einer anti-angiogenetischen Behandlung eine wichtige Rolle spielen.

Ziel dieser Arbeit ist es, eine effektive, selektive und homogene Applikation von bekannten Angiogenesefaktoren in eine ischämische Extremität zu etablieren. Die Induktion therapeutischer Angiogenese im ischämischen Hinterlauf ist bereits über den arteriellen Weg wie auch über eine intramuskuläre Applikation gelungen. Als Alternative, das ischämische Gewebe über eine stark stenosierte oder sogar verschlossene Arterie oder aber inhomogen über eine intramuskuläre Injektion zu erreichen, wird in dieser Arbeit das intakte venöse Gefäßsystem unter Verwendung der Retroinfusion genutzt. Hierfür kommt basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) als etablierter Angiogenesefaktor zur Anwendung. Die Retroinfusion wird hierbei mit der intramuskulären Applikation verglichen. Darüber hinaus wird überprüft, ob eine zusätzliche low-dose Ko-Applikation von Vascular Endothelial Derived Growth Factor (VEGF) einen additiven Effekt erzielen kann. Die chronische Ischämie im Hinterlauf des Kaninchens wird am Tag 0 mittels Exzision der Arteria femoralis und Ligatur ihrer Aufzweigungen erreicht. Am Tag 7 wird die Baseline für die Kollateralenanzahl mittels Angiographie und ein Korrelat für die Blutflussgeschwindigkeit in den Kollateralen (Frame Count Score) ermittelt. Anschließend erfolgt die retrograde Applikation von NaCl- Lösung (Kontrollgruppe) oder bFGF (20 μg/kg KG) mit oder ohne VEGF165 (10 μg/kg) über eine Unterschenkelvene. Alternativ wird bFGF (20 μg/kg KG) in die Ober- und Unterschenkelmuskulatur injiziert. Am Tag 35 werden erneut die Kollateralenanzahl wie auch der Frame Count Score ermittelt. Darüber hinaus werden Muskelproben zur Bestimmung des Kappilarwachstums entnommen. Die Ergebnisse zeigen, dass in der Kontrollgruppe das Kapillarwachstum wie auch die Kollateralenanzahl am Tag 35 im Vergleich zum Tag 7 nicht signifikant zunehmen. Die retrograde Applikation von bFGF induziert hingegen eine signifikante Zunahme des Kapillarwachtums und der Kollateralenanzahl, woraus sich eine höhere Blutflussgeschwindigkeit (Frame Count Score) ableiten lässt. Die Ergebnisse entsprechen denjenigen der intramuskulären bFGF Applikation. Die low-dose Ko-Applikation von VEGF165 als Retroinfusion kann keine weitere Verbesserung im Vergleich zur alleinigen bFGF Gabe induzieren. Zusätzlich wurde mit Hilfe szintigraphischer Methoden die venöse retrograde Infusion mit der antegraden arteriellen Applikation verglichen. Hierbei zeigte sich eine effektive, selektive und homogenen Verteilung der infundierten Lösung im Zielgebiet mit einer deutlich verlängerten Verweildauer zu Gunsten der Retroinfusion. Es kann postuliert werden, dass durch eine einmalige venöse Retroinfusion von bFGF Angiogenese und damit ein gesteigerter Blutfluss im Modell des chronischen ischämischen Hinterlaufs des Kaninchens wirkungsvoll induziert werden kann. Zusammenfassend erscheint die venöse retrograde Verabreichung von Wachstumsfaktoren in ein ischämisches Gebiet als eine effektive Methode, Kollateralwachstum und Kapillarsprossung mit folgender Verbesserung des Blutflusses zu induzieren. Da es sich hierbei um ein klinisch anwendbares Applikationsverfahren handelt, könnte dieser Ansatz zu einer Verbesserung der klinischen Effektivität der therapeutischen Angiogenese führen.

Die Zahl der Patienten mit arteriellen Gefäßverschlüssen nimmt stetig zu. Eine Alternative zu invasiven Techniken stellt die Förderung des körpereigenen Kollateralwachstums (Arteriogenese) dar. Arteriogenese beschreibt die Entwicklung von großlumigen Kollateralarterien aus präexistenten arteriellen oder arteriolären Anastomosen, während Angiogenese die Neuentwicklung von kapillären Netzwerken beschreibt. Aufgrund des Hagen-Poiseuillschen Gesetzes bedarf es für den Ersatz von Arterien größerer Gefäße, die nicht durch Angiogenese entstehen können. Experimentell lässt sich das Wachstum von Kollateralarterien durch Granulozyten-Makrophagen-Kolonie Stimulierender Faktor (GM-CSF) fördern. Die Wirkung von GM-CSF auf die Arteriogenese in größeren Organismen ist jedoch noch unbekannt und soll in einem Schweinehinterlaufmodell überprüft werden. Material und Methoden: Die rechte Femoralarterie von 24 Schweinen Deutscher Landrasse (n=8/Gruppe) wurde ligiert, kanüliert und an eine implantierte Pumpe angeschlossen. Die erste Gruppe erhielt 0,9%Natriumchloridlösung, in der zweiten Gruppe wurden die Tiere kontinuierlich mit GM-CSF 5 µg/kg/d behandelt, die Tiere der dritten Gruppe erhielten die selbe Tagesdosis in einem intermittierenden Applikationsmodus (1h Infusion, 7h Pause, 3Zyklen/d). Nach einwöchigem Behandlungszeitraum wurde die kollaterale Konduktanz bestimmt unter maximaler Vasodilatation sowie weitere klinische Parameter (ABI, Fluss unter Hyperämie, Angiographien) bestimmt. Ergebnisse: Angiographisch und durch Bestimmung des ABI ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen. Funktionelle Untersuchungen zeigten jedoch, dass sowohl die kontinuierliche als auch die intermittierende Applikation von GM-CSF zu einer signifikanten Steigerung der reaktiven Hyperämie und der kollateralen Konduktanz im Vergleich zur Kontrollgruppe führte ([ml/min/mmHg] NaCl:37,73±5,42; GM-CSF kont.:69,16±12,46; GM-CSF interm.:71,50±11,08). Schlussfolgerung: Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit von GM-CSF als pro-arteriogene Substanz im Großtierorganismus. Die intermittierende Anwendung von GM-CSF führte zu keiner signifikanten Wirkungssteigerung im Vergleich zur kontinuierlichen Infusion. Eine tachyphylaktische Rezeptorregulation unter GM-CSF-Therapie in der Arteriogenese erscheint somit unwahrscheinlich. Der Einsatz von programmierbaren Infusionspumpen stellt eine mögliche Lösung für die intravasale Anwendung bei Menschen mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit dar

It is unclear how angiogenesis and restoration of perfusion determine graft function after free parathyroid autotransplantation.We provide a new animal model allowing simultaneous and repetitive in vivo assessment of angiogenesis and endocrine function of parathyroid transplants. Methods:Fresh human parathyroid tissue from patients with secondary hyperparathyroidism was grafted into dorsal skinfold chamber preparations of athymic nude mi(CD1-nu BR; n=8). Equivalent pieces of the same human donor specimens were heat-inactivated and served as control grafts (n=7).Results:In all animals receiving parathyroid transplants human parathyroid hormone levels were detectable by species-specific ELISA analysis of plasma samples on day 5 after transplantationand increased by 2.5 fold over the observation (19 days) in contrst to controls (day 19: 82.5+/-29.3 vs. 0.0+/-0.0 pg/ml; p

Die Applikation vaskulärer Wachstumsfaktoren zur Stimulation des Kollateral- (therapeutische Arteriogenese) und des Kapillarwachstums (therapeutische Angiogenese) stellt einen möglichen neuen Ansatz in der Behandlung der koronaren Herzerkrankung dar. Der klinische Einsatz vaskulärer Wachstumsfaktoren ist derzeit aber vor allem durch ein klinisch verfügbares sicheres und effektives Applikationsverfahren limitiert. Die selektive synchronisierte druckregulierte Retroinfusion (SSR) von Koronarvenen ist ein klinisch etabliertes Herzkatheterverfahren und erlaubt eine effektive Applikation von Medikamenten und Genvektoren in ischämisches Myokardgewebe. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb die Auswirkung der Retroinfusion des vaskulären Wachstumsfaktors FGF-2 in die Koronarvene auf das Kollateralwachstum (Arteriogenese), das Kapillarwachstum (Angiogenese), den myokardialen Blutfluss und die kontraktile Myokardfunktion bei chronischer, experimenteller Myokardischämie (Schwein) untersucht, und mit der intrakoronaren Applikation von FGF-2 verglichen. Eine hochgradige koronararterielle Stenose, mit Progression zur Komplettokklusion bis zum Tag 28 der Untersuchung, wurde durch Implantation eines Reduktionsstent-Graft in die LAD induziert. Nach 7 Tagen wurde eine 30 minütige Retroinfusion (anteriore Herzvene) ohne (Kontrollgruppe A, n=7) und unter Zugabe von 150µg FGF-2 (Gruppe B, n=7) durchgeführt, und mit der antegraden Infusion (30 min) von FGF-2 in die Koronararterie (LAD) verglichen (Gruppe C, n=7). 28 Tage nach Implantation des Reduktionsstent erfolgte die Bestimmung der Anzahl der Kollateralarterien (post-mortem Angiographie) und der Kapillardichte (Histologie, Färbung für alkalische Phosphatase). Der regionale myokardiale Blutfluss (fluoreszierende Mikrosphären) und die kontraktile Myokardfunktion (Sonomikrometrie) wurden unter Ruhebedingungen und Bedingungen mit gesteigertem Sauerstoffbedarf (rechts-atriales Pacing) gemessen. Am Versuchende, 28 Tage nach Implantation des Reduktionsstent, konnte die Retroinfusion von FGF-2 in die Koronarvene (Gruppe B), verglichen mit den unbehandelten Kontrolltieren (Gruppe A) und der antegraden Applikation von FGF-2 in die Koronararterie (Gruppe C), eine signifikante Zunahme der Kollateralarterien (5,2±1,1 vs. 2,95±0,4 vs. 3,3±0,3, p

Introduction: Antiangiogenetic cancer therapy is a potential new form for treatment of solid tumors. The alpha-v-integrins ( avb3, avb5) mediate the contact of activated endothelial cells to proteins of the extracellular matrix during tumor angiogenesis as a prerequisite for survival of endothelial cells. The aim of this study was to investigate the effects of inhibition of alpha-v-integrins with a methylated cyclic RGD-peptide on angiogenesis, microcirculation, growth and metastasis formation of a solid tumor in vivo. Methods: Experiments were performed in the dorsal skinfold preparation of Syrian Golden hamsters bearing the amelanotic hamster melanoma A-Mel-3. Animals were injected intraperitoneally with a methylated cyclic RGD-peptide every 12 hours, the control group received an inactive peptide. Microcirculatory parameters of tumor angiogenesis including functional vessel density, red blood cell velocity (vRBC), vessel diameter and leukocyte endothelium interaction were analyzed using intravital microscopy. In an additional study the effects on growth and metastasis of subcutaneous A-Mel-3 were quantified. Results: Functional vessel density was markedly reduced on day 3 in treated animals compared to controls (37.2+/-12.1 vs. 105.2+/-11.2 cm-1; mean+/-SEM; P < 0.05), and increased subsequently in both groups. vRBC at day 3 was below values of controls (0.026+/-0.01 vs. 0.12+/-0.03 mm/s; P < 0.05). No differences were observed in vessel diameters and leukocyte-endothelium interaction was almost absent in both groups. Furthermore, growth and metastasis of subcutaneous tumors after administration of the cyclic RGD-peptide was significantly delayed in comparison to controls (P < 0.05). Conclusion: Inhibition of alpha-v-integrins by a cyclic RGD-peptide resulted in significant delay of early tumor angiogenesis, associated with retardation of tumor growth and metastasis in vivo. Application of cyclic RGD-peptides may thus be a promising approach for antiangiogenic therapy of solid tumors

Oxidiertes “Low density Lipoprotein“ (LDL) trägt durch Aktivierung von vaskulären End othelzellen und Thrombozyten zum Fortschreiten der Atherosklerose bei. Da die durch milde oxidiertes LDL (mox-LDL) aktivierten Signalwege in Endothelzellen und Thrombozyten bisher nur unzureichend charakterisiert waren, wurden sie in dieser Arbeit näher untersucht. Weiterhin wurde ausgehend von der Beobachtung, daß es bei milder Oxidation von LDL zur Bildung von Lysophosphatidsäure (LPA) kommt, und daß LPA die spezifische Thrombozyten- aktivierende Substanz im milde oxidierten LDL ist, in dieser Arbeit in in vitro Modellen untersucht, ob LPA und das strukturell und funktionell verwandte Lysophospholipid Sphingosin- 1-Phosphat (S1P) Signalwege regulieren, die zur pathologischen Aktivierung von Thrombozyten und Endothelzellen beitragen. Als Modellsysteme wurden unter anderem die endotheliale Permeabilität und der Plättchen-“shape change“ herangezogen. Es konnte gezeigt werden, daß milde oxidiertes LDL und LPA sowohl in Endothelzellen als auch in Thrombozyten - über Membran-gebundene LPA-Rezeptoren - die GTPase Rho und deren Effektor- Molekül Rho-Kinase aktivieren. Rho-Kinase hemmt die Myosin Leichtketten Phosphatase, wodurch es zum Anstieg der Myosin Leichtketten Phosphorylierung kommt. Myosin Leichtketten Phosphorylierung führt (i) zur Kontraktion von Endothelzellen, die wiederum einen Anstieg der endothelialen Permeabilität auslöst, und (ii) zur Formveränderung (shape change) von Thrombozyten, dem ersten Anzeichen der Plättchen-Aktivierung. Das Lysophospholipid S1P dagegen induziert in Endothelzellen sequentiell (1) Rho/Rho-Kinase abhängige Myosin Leichtketten Phosphatase-Inaktivierung, Myosin Leichtketten Phosphorylierung und Endothelzellkontraktion, (2) Rac abhängige Myosin Leichtketten Phosphatase-Aktivierung, Ausbildung von “membrane ruffles“ und Endothelzellausbreitung und (3) erneute Rho/Rho- Kinase abhängige Myosin Leichtketten Phosphatase-Inaktivierung und Endothelzellkontraktion. Das durch S1P regulierte Wechselspiel zwischen Rho- und Rac-Aktivität und die dadurch regulierten Sequenzen von Zellkontraktion und -ausbreitung sind wahrscheinlich für die Endothelzellmigration im Rahmen von Angiogenese und Wundreparatur von Bedeutung. Den Lysophospholipiden könnte also eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose und in der Regulation von Angiogenese und Wundreparatur zukommen. Die pharmakologische Hemmung des Rho/Rho-Kinase Signalweges könnte möglicherweise einen neuen Ansatzpunkt zur Behandlung der Atherosklerose darstellen.